Однією з найважливіших їхніх турбот була шкільна справа. У кінці XVI ст. Львівське братство заснувало власну школу. Всі викладачі в ній, за винятком ученого грека Арсенія, а саме Зизаній Тустановський, Кирило Ставровецький та майбутній митрополит Іов Борецький, походили з місцевого населення. Про надмірно суворі, якщо взагалі реалістичні правила, якими у своїй діяльності керувалися ця та інші братські школи України, свідчить статут, так званий «Порядок шкільний»: вчитель мав бути «набожним, мудрим, скромним, стриманим, а не пиякою, гулякою, хабарником». Наголошуючи на тій великій відповідальності, що лежала на викладачах, ці правила заохочували їх «добре навчати і карати неслухняних не як тиран, а для науки». Львівська школа користувалася такою повагою, що інші братства зверталися до неї з проханням надати пораду, вирядити вчителів, проповідників, надіслати книги. На початку XVII ст. численні братські школи існували по всій Україні.
Іншою важливою цариною діяльності Львівського братства, започаткованою ще до існування школи, було книгодрукарство. Коли до Львова приїхав Іван Федоров, братство допомогло йому заснувати друкарню. У 1574 р. з’являється його перша книжка «Апостол». Це була видатна подія, що ознаменувала початок книгодрукарства на Україні. У 1582 р. Федоров повертається до Львова, де наступного року помирає у великих злиднях. Коли кредитори стали погрожувати тим, що відберуть у нього друкарню, її купило Львівське братство, перетворивши місто на центр православного книгодрукарства.
Поширення шкіл і друку розбудило колись пасивних і консервативних українців. Сотні вихованців шкіл, пройнятих духом національних традицій, а також обізнаних із західноєвропейською наукою, ставали мандрівними вчителями, розходилися по містах і селах у пошуках заробітку. Крім сучасних знань, вони несли почуття власної гідності й непримиренності. Замість того щоб переходити у польський католицизм, вони із зростаючою рішучістю стали боронити релігійні традиції, що відрізняли їх від поляків. Прикладом цих нових явищ у духовному житті є успішний опір Львівського братства спробам польських католиків нав’язати григоріанський календар.
Без сумніву, всі ці зміни великою мірою були результатом діяльності братств. Проте мали вони також і вади. Вічною проблемою була нестача фінансових засобів. Незважаючи на повсюдне поширення, братства так і не утворили якогось координуючого органу і їхні взаємозв’язки були спорадичними. Діяльність братств характеризується непослідовністю, оскільки навіть провідне Львівське братство залежало від кількох окремих людей. Коли ж ці люди втрачали ентузіазм, стомлювалися чи (як це траплялось з учителями) знаходячи собі десь в іншому місці надійну й краще оплачувану посаду, діяльність братства нерідко припинялася на тривалий час. Ще серйознішою була суперечка про те, чи мають право братства втручатися у справи церкви. Як і належало сподіватися, між ними та єпископами спалахували конфлікти за контроль над маєтностями якогось багатого монастиря (прикладом цього може бути запекла боротьба між єпископом львівським Балабаном та місцевим братством), або мали місце суперечки між єпископом та міщанами навколо того, як тлумачити Біблію. У результаті замість сприяння відновленню православної церкви братства нерідко спричинялися до ще більшої анархії в ній.
Із самого моменту розколу в 1054 р. ідея возз’єднання розглядалася як католицькою, так і православною церквою. На Україні спроби їх об’єднання почалися ще в XIII ст., а після Флорентійського собору, що відбувся у 1439 р., цю ідею мало не було здійснено. Проте на шляху привабливого за своєю суттю поняття християнської єдності лежали століття взаємної підозріливості та недоброзичливості. Православні найбільш побоювалися, що в разі об’єднання могутня католицька церква намагатиметься підпорядкувати їх собі. Ці побоювання були небезпідставними, бо протягом XVI ст. впевнені у власній зверхності польські католики домагалися унії, сподіваючись, що вона неминуче приведе до асиміляції українського православ’я й дальшого поширення впливу польського католицизму. В 1577 р. великого розголосу набув аргументований трактат Пйотра Скарги «Про єдність Церкви Божої». Водночас єзуїти активно переконували українських магнатів підтримати ідею унії. Навіть князь Острозький оголосив, що в принципі згоден на унію. А Сигізмунд III, ревний католик, використав увесь свій авторитет для сприяння цій справі. Крім релігійного запалу, до унії його схиляли певні політичні міркування, оскільки вона тісніше зв’язала б Україну та Білорусію з Річчю Посполитою й віддалила б їх від небезпечного впливу сусідньої православної Московії.
Як не дивно, безпосередній заклик до укладення унії надходив від православної сторони. У 1590 р. православний єпископ Львова Гедеон Балабан, розлючений безкінечними суперечками з братством, а ще більше — нетактовним втручанням константинопольського патріарха, порушив питання про унію з Римом на таємній зустрічі православних єпископів у Белзі. Крім Балабана, докладніше вивчити це питання погодилися ще три єпископи: Кирило Терлецький із Луцька, Дионісій Збируйський із Холма та Леонтій Пелчицький із Турова. Згодом до змовників пристав Іпатій Потій з Володимира. Разом з Терлецьким цей енергійний недавно висвячений феодал і колишній кальвініст став на чолі змови єпископів за укладення унії.
Цими єпископами керували як власні інтереси, так і щира занепокоєність долею церкви. Вони вірили, що високоавторитетна і добре організована католицька церква впровадить серед православних жаданий порядок та дисципліну. А ще вони сподівалися, що внаслідок цього зросте престиж єпископів серед духовенства та мирян. Ставши частиною католицької церкви, православні, на думку цих єпископів, дістануть повну рівноправність у Речі Посполитій, українські міщани не будуть більше зазнавати дискримінації в містах, а православну знать перестануть ігнорувати при розподілі службових посад. Більше того, єпископи теж мали б вигоду від унії, бо, отримавши рівний з католицькими ієрархами статус, вони стали б членами впливового Сенату. Спонукувані такими привабливими перспективами, провівши кілька таємних зустрічей з королівськими урядовцями, католицькими єпископами та папським нунцієм, чотири православних єпископи погодилися у червні 1595 р. укласти між своєю церквою та Римом унію. За умов гарантії збереження традиційної православної літургії та обрядів, а також таких звичаїв, як право священиків брати шлюб, вони приймали верховний авторитет Риму в усіх справах віри та догми. Наприкінці 1595 р. Терлецький і Потій поїхали до Риму, де папа Клемент VIII проголосив офіційне визнання унії.
Коли розійшлася звістка про унію, православна громада вибухнула від обурення. Найвидатніший її представник князь Острозький був розлючений не самою унією, а тим, в який спосіб її укладено. У широко розповсюдженому відкритому листі він оголосив чотирьох єпископів «вовками в овечій шкурі», які зрадили свою паству, й закликав віруючих до протесту. Надіславши офіційну скаргу королю, яку було проігноровано, Острозький вступив у антикатолицьку спілку з протестантами, погрожуючи підняти збройне повстання. Водночас по всіх українських та білоруських землях православна знать збирала свої місцеві ради (сеймики), на яких гнівно засуджувала унію. Перелякані такими подіями, ініціатори всієї справи єпископи Балабан і Копистенський зреклися своїх колег та оголосили про свою формальну опозицію унії.
Щоб розв’язати конфлікт, у 1596 р. в м. Бересті (Бресті) був скликаний церковний собор. Ніколи не бачили Україна і Білорусія таких величезних зборів духовенства. Противників унії представляли два вищезгаданих єпископи, православні ієрархи з-за кордону, десятки виборних представників знаті, понад 200 священиків та численні миряни. Водночас у таборі її прибічників була жменька католицьких сановників, королівських урядовців і четверо православних єпископів. Із самого початку стало очевидним, що сторони не можуть знайти спільної мови. Зрозумівши, що переговори не мали ніякого сенсу, прибічники унії публічно підтвердили свої наміри укласти її.