Как уже сказано, Прохор вступил в Саровскую обитель 20-го ноября 1778 года, накануне праздника Введения во храм Пресвятой Богородицы. Стоя в церкви на всенощном бдении, видя благочинное совершение службы, замечая, как все, от настоятеля до последнего послушника, усердно молятся, он восхитился духом и порадовался, что Господь указал ему здесь место для спасения души. О. Пахомий с малолетства знал родителей Прохора и потому с любовью принял юношу, в котором видел истинное стремление к иночеству. Он определил его в число послушников к казначею иеромонаху Иосифу, мудрому и любвеобильному старцу. Сперва Прохор находился в келейном послушании старца и с точностью исполнял все монашеские правила и уставы по его указанию; в келии он служил не только безропотно, но и всегда с усердием. Такое поведение обратило на него внимание всех и приобрело ему расположение старцев Иосифа и Пахомия. Тогда ему стали назначать, кроме келейного, ещё послушания по порядку: в хлебне, в просфорне, в столярне. В последней он был будильщиком и исполнял довольно долго это послушание. Затем он исполнял пономарские обязанности. Вообще, юный Прохор, бодрый силами, проходил все монастырские послушания с великою ревностью, но, конечно, не избег многих искушений, как печали, скуки, уныния, которые действовали на него сильно.
Жизнь юного Прохора до пострижения в монашество ежедневно распределялась так: в определённые часы он был в церкви на богослужении и правилах. Подражая старцу Пахомию, он являлся как можно раньше на церковные молитвы, выстаивал неподвижно всё богослужение, как бы продолжительно оно ни было, и никогда не выходил прежде совершенного окончания службы. В часы молитвы всегда стоял на одном определённом месте. Для предохранения от развлечения и мечтательности, имея глаза опущенными долу, он с напряжённою внимательностью и благоговением слушал пение и чтение, сопровождая их молитвою. Прохор любил уединяться в своей келии, где у него, кроме молитвы, были занятия двух родов: чтение и телесный труд. Псалмы он читал и сидя, говоря, что утруждённому это позволительно, а св. Евангелие и послания Апостолов всегда стоя пред св. иконами, в молитвенном положении, и это называл бдением (бодрствованием). Постоянно он читал творения св. отцов, напр. Шестоднев св. Василия Великого, беседы св. Макария Великого, Лествицу преп. Иоанна, Добротолюбие и проч. В часы отдохновения он предавался телесному труду, вырезывал кресты из кипарисного дерева для благословения богомольцам. Когда Прохор проходил столярное послушание, то отличался большим усердием, искусством и успехами, так что в расписании он один из всех назван Прохором — столяром. Он также ходил на общие для всей братии труды: сплавлять лес, приготовлять дрова и т.п.
Видя примеры пустынножительства о. игумена Назария, иеромонаха Дорофея, схимонаха Марка, юный Прохор стремился духом к большему уединению и подвижничеству, а потому испросил благословение своего старца о. Иосифа оставлять монастырь в свободные часы и уходить в лес. Там он нашёл уединённое место, устроил сокровенную кущу и в ней совершенно один предавался богоразмышлению и молитве. Созерцание дивной природы возвышало его к Богу, и, по словам человека, бывшего впоследствии близким к старцу Серафиму, он здесь совершал правило, еже даде Ангел Господень Великому Пахомию, учредителю иноческого общежития. Это правило совершается в следующем порядке: Трисвятое и по Отче наш: Господи, помилуй, 12. Слава и ныне: приидите поклонимся — трижды. Псалом 50: Помилуй мя, Боже. Верую во единого Бога... Сто молитв: Господи Иисусе Христе, Сыне Божий, помилуй мя грешного и по сём: Достойно есть и отпуст.
Это составляло одно моление, но таких молитв надлежало совершить по числу суточных часов, двенадцать днём и двенадцать ночью. С молитвою он соединял воздержание и пост: в среду и пятницу не вкушал никакой пищи, а в другие дни недели принимал её только один раз.
В 1780 году Прохор тяжко заболел, и всё тело его распухло. Ни один врач не мог определить вида его болезни, но предполагали, что это сделалась водяная болезнь. Недуг длился в продолжение трёх лет, из которых не менее половины Прохор провёл в постели. Строитель о. Пахомий и старец о. Исаия попеременно ходили за ним и почти неотлучно находились при нём. Тут-то и открылось, как все, и прежде других начальники, уважали, любили и жалели Прохора, бывшего тогда ещё простым послушником. Наконец, стали опасаться за жизнь больного, и о. Пахомий настоятельно предлагал пригласить врача или, по крайней мере, открыть кровь. Тогда смиренный Прохор позволил себе сказать игумену: «Я предал себя, отче святый, Истинному Врачу душ и телес, Господу нашему Иисусу Христу и Пречистой Его Матери; если же любовь ваша рассудит, снабдите меня, убогого, Господа ради, небесным врачевством — причастием Св. Тайн». Старец Иосиф, по просьбе Прохора и собственному усердию, особо отслужил о здравии больного всенощное бдение и литургию. Прохор был исповедан и причащён. В скором времени он выздоровел, что весьма удивило всех. Никто не понимал, как мог он столь скоро оправиться, и только впоследствии о. Серафим открыл тайну некоторым: после причащения Св. Таин ему явилась Пресвятая Дева Мария, в несказанном свете, с Апостолами Иоанном Богословом и Петром и, обратясь к Иоанну лицем и указывая перстом на Прохора, Владычица сказала: «Этот Нашего рода!»
«Правую-то ручку, радость моя,— говорил о. Серафим церковнице Ксении,— положила мне на голову, а в левой-то ручке держала жезл; и этим-то жезлом, радость моя, и коснулась убогого Серафима; у меня на том месте, на правом бедре-то, и сделалось углубление, матушка; вода-то вся в него и вытекла, и спасла Царица Небесная убогого Серафима; а рана пребольшая была, и до сих пор яма-то цела, матушка, погляди-ка, дай ручку!» — «И батюшка, бывало, сам возьмёт, да и вложит мою руку в яму,— прибавляла матушка Ксения,— и велика же она была у него, так вот весь кулак и взойдёт!» Много душевной пользы принесла Прохору эта болезнь: дух его окреп в вере, любви и надежде на Бога.
В период послушничества Прохора, при настоятеле о. Пахомии, предприняты были в Саровской пустыне многие нужные постройки. В числе их на месте келии, в которой болел Прохор, строилась больница для лечения недужных и успокоения престарелых, и при больнице церковь о двух этажах с престолами: в нижнем во имя свв. Зосимы и Савватия, чудотворцев Соловецких, в верхнем — во славу Преображения Спасителя. Прохор после болезни, молодой ещё послушник, был посылаем за сбором денег в разные места на сооружение церкви. Благодарный за своё исцеление и попечение начальства, он с охотою понёс трудный подвиг сборщика. Странствуя по ближайшим к Сарову городам, Прохор был и в Курске, на месте своей родины, но не застал уже матери своей в живых. Брат Алексей, со своей стороны, оказал Прохору немалую помощь для построения церкви. Вернувшись домой, Прохор, как искусный столяр, построил собственными руками престол из кипарисного дерева для нижней больничной церкви в честь преподобных Зосимы и Савватия.
В течение восьми лет юный Прохор был послушником. Наружный вид его к этому времени изменился: будучи высокого роста, около 2 арш. и 8-ми вершков, несмотря на строгое воздержание и подвиги, он имел полное, покрытое приятною белизною, лицо, прямой и острый нос, светло-голубые глаза, весьма выразительные и проницательные; густые брови и светло-русые волосы на голове. Лицо его окаймлялось густою, окладистою бородою, с которою на оконечностях рта соединялись длинные и густые усы. Он имел мужественное сложение, обладал большими физическими силами, увлекательным даром слова и счастливой памятью. Теперь он прошёл уже все степени монастырского искуса и был способен и готов принять монашеские обеты.