При Острожской школе собрался кружок высокообразованных православных разных национальностей. Выли среди них греки, уже успевшие получить высшее образование в университетах Западной Европы (Никифор Лукарис, впоследствии патриарх), но преобладали выходцы из украинско-белорусской среды. Наиболее значительными учеными среди них были богословы и филологи Герасим Смотрицкий и его сын Максим, более известный под своим монашеским именем Мелетий, церковные полемисты Иван Вишенский и Василий Красовский, писатель и ученый Демьян (Дамиан) Наливайко, старший брат Северина Наливай ко — сотника надворной хоругви князя Острожского, ставшего легендарным предводителем казацкого восстания 1595–1596 годов.
Острожская Библия. 1581. Титульная страница.
В круг друзей Константина-Василия Острожского входил и бежавший из Московского царства от зверств Ивана Грозного князь Андрей Курбский, отличавшийся начитанностью и острым умом. В 1575 году по просьбе Константина-Василия из Львова в Острог переехал вынужденный ранее покинуть свою страну московский первопечатник Иван Федоров (в Украине известный также как Федорович). Он был приглашен для работы в основанной (а, скорее, восстановленной) в 1571 году Константином-Василием типографии.
Опираясь на собравшихся вокруг него ученых и просветителей, князь задумал грандиозное дело — издание Библии на церковнославянском языке. В то время уже существовали переводы отдельных книг Старого и Нового Заветов, многие из которых восходили еще к первоучителям славянства Кириллу и Мефодию. Однако сохранялись эти переводы в единичных рукописных экземплярах в различных уголках православно-славянского мира, часто изобиловали допущенными переводчиками и переписчиками неточностями и явными ошибками, содержали разночтения, искажавшие толкование Священного Писания. При этом многие важные библейские тексты в славянском варианте не существовали вообще и их предстояло перевести с греческого с учетом уже имевшегося латинского перевода.
Князь энергично взялся за организацию издания Библии. На его личные средства были отправлены по разным городам люди, которые искали библейские греческие тексты и их славянские переводы. Оригиналы или копии везли в Острог, где они сверялись, редактировались и сводились в единый церковнославянский корпус книг, получивший название «Острожская Библия». Снабженная высокохудожественными гравюрами, она была издана в 1581 году.
Издание «Острожской Библии» в условиях усиливавшегося польско-католического давления и неутешительного состояния православия в целом (после разорения монголами княжеств Руси и гибели под ударами крестоносцев и турок Византии) было культурно-просветительским подвигом. Образованные славяне восточного обряда получали в руки настоящие библейские тексты на понятном им языке. По своему значению этот труд сопоставим с переводом и публикацией Библии на немецком языке, которые на полвека ранее осуществил Лютер.
Экземпляры изданной Библии начали быстро расходиться по украинско-белорусским землям Речи Посполитой, попадая в пределы Московского царства, а также к находившимся под властью турок болгарам и сербам. Этим изданием широко пользовались люди духовного звания и православные аристократы. Однако особую роль «Острожская Библия» играла в демократической среде православных братств, массово возникавших в городах Украины и Белоруссии во второй половине XVI века. Наиболее многочисленным и влиятельным считалось Львовское братство, а с начала XVII века — Киевское. Именно братства стали очагами православной образованности, имели школы и даже библиотеки.
Работа Острожской типографии не ограничивалась изданием только Библии, в ней печаталась разнообразная богослужебная и учебная литература. В 1587 году в Остроге издается первый полемический, направленный на защиту православной веры от нападок со стороны католичества, труд Герасима Смотрицкого «Ключ царства небесного», а в следующем году — «Книжица» Василия Сурожского того же идейного направления.
Особая роль принадлежит князю Константину Константиновичу в борьбе с насаждением унии на украинско-белорусских землях в конце XVI — начале XVII веков.
Брестская уния 1596 года готовилась втайне от православной общественности и ее принятие «князьями церкви» было для основной массы не только прихожан, но и рядовых священников и монахов полной неожиданностью. Уния внесла раскол в украинско-белорусское общество в наиболее ответственный момент его истории.