В то же время польские власти создавали условия для окатоличивания представителей высших слоев украинского общества, предоставляя шляхте латинского обряда права, которыми была обделена шляхта православная (быть избранными на высшие правительственные должности — воевод и каштелянов, — а значит, заседать в сенате и реально быть среди первых людей Речи Посполитой, влияя на ее политику).
В ситуации всестороннего давления на последователей византийского обряда князь Константин Острожский оказался среди самых стойких православных аристократов и государственных деятелей Речи Посполитой высшего ранга, которые выступили против унии (кроме него это были князья Збаражские, Друцкие-Соколинские, Корецкие и др.; интересно, что в неправославной среде уния также не везде нашла поддержку: против нее выступили некоторые государственные деятели из числа римо-католиков и протестантов).
Особенное негодование князя Константина вызвало тайное, без обсуждения православной общественностью, заключение Брестской унии. В широко распространенном письме он провозгласил инициаторов унии «волками в овечьей шкуре», предавшими свою паству, и призывал верующих к открытому противостоянию. Послав официальный протест королю Сигизмунду III (который его проигнорировал), Константин Острожский вступил в антикатолический союз с польскими протестантами, угрожая поднять вооруженное восстание. Под его влиянием оставшаяся верной православию шляхта (часть которой уже входила в круги формировавшегося казачества) собиралась на уездные (волостные) сеймы и высказывалась против унии. Ведущие монастыри, и прежде всего Киево-Печерская лавра, которую в то время возглавлял ярый ревнитель православия Никифор Тур, решительно отвергли унию и предали проклятию ее инициаторов.
Этими решительными действиями Константину Острожскому совместно с друзьями и сподвижниками (Никифором Туром, Иваном Вишенским, острожским шляхтичем Мартином Броневским, писавшим под псевдонимом Христофор Филалет и др.) удалось во многом сорвать планы приведения в состояние унии всего украинско-белорусского православия. В 90-х годах XVI века в Украине появляется целое направление религиозно-полемической литературы, достигшее своего расцвета в следующие десятилетия.
Однако на православных землях польско-литовского государства возможности противостоять униатству и католическому давлению были не у всех одинаковыми. В ближайшей к Польше Галиции и на большей части Волыни позиции католицизма к концу XVI века были уже весьма сильны и власть принадлежала католикам, в том числе из знатных западно-украинских родов. Но Среднее Поднепровье было затронуто польско-католическим влиянием еще относительно мало. Более того, пост киевского воеводы сохранял за собой приверженец православия Константин Острожский.
Это не позволяло сторонникам унии широко (как в Галиции или Литве) предпринимать в Киеве и округе насильственные действия против православных. Подчинению папе здесь решительно противились все сословия, в особенности само духовенство, казаки и горожане.
Стоит сказать и о меценатской деятельности князя Острожского в поддержку православной церкви. В Киеве благодаря его заботам и материальной помощи были восстановлены Кирилловский и Межигорский монастыри, нового расцвета достигла Киево-Печерская лавра, на Подоле были построены церкви Николы Доброго и Рождественско-Предтечинская. По преданию, он был патроном более 1000 православных церквей по всей Украине.
Меценатство, издательская деятельность и политическое заступничество Константина Константиновича, его неутомимая просветительская работа помогли украинскому православию выстоять и окрепнуть в годы католического давления и насаждения униатства.
Однако процесс окатоличивания и полонизации украинско-белорусской аристократии приобретал необратимый характер. В католицизм переходили некогда известнейшие православные княжеские дома. Более того, еще при жизни Константина-Василия его дети тоже перешли в католицизм, а единственный оставшийся верным православию сын Александр умер раньше отца.
В XVII веке на авансцену украинской истории выходят новые, сохранявшие верность православию, социально активные слои — горожане (мещане) и духовенство, главным образом самого Киева, а также становящееся грозной военной силой запорожское казачество.
Мелетий Смотрицкий (1572 или 1578–1633) церковный деятель, просветитель, писатель-полемист, филолог
Ситуация, сложившаяся на украинско-белорусских землях в результате принятия верхушкой церковной иерархии Брестской унии 1596 года, породила глубокие противоречия в настроениях верующих. Особенно это относилось к образованной части православных в пределах польско-литовского государства.