С тех пор как голландец Антон ван Левенгук в 1673 году с помощью изобретенной им лупы, увеличивавшей в 300 (!) раз, открыл невиданный ранее мир бактерий, оптические устройства все совершенствуются. Прибор с одной линзой заменили многолинзовые микроскопы, которые продолжали наращивать предел увеличения до тех пор, пока не натолкнулись на дифракционный предел. Его еще называют пределом Аббе по имени немецкого оптика, открывшего это явление в 1873 году.
Эрнст Аббе установил, что оптический микроскоп не может четко показать объекты, размер которых меньше половины длины световой волны. Длина волны электронов меньше, чем у фотонов, поэтому возможности электронных микроскопов больше, но и перед ними неумолимо встает дифракционный предел. Во многих случаях исследователей выручает атомно-силовой микроскоп, но и его возможности не беспредельны.
«Дифракционный барьер установлен где-то в пределах 200–250 нм — рассказал журналистам доктор биологических наук, заведующий лабораторией Института биоорганической химии РАН Константин Лукьянов. — Флуоресцентная микроскопия преодолевает этот предел, достигая разрешения 20–25 нм, то есть на порядок больше. Это позволяет видеть отдельные структуры, причем в живых клетках, где можно увидеть какие-то внутриклеточные процессы».
Технологически это решается двумя разными способами, но если не вдаваться в детали, суть тут такова. Исследователь вносит в клетку флуоресцентную метку, помечая при этом какую-то определенную структуру, какой-то белок или какое-то событие в клетке. Флуоресцентный краситель при этом возбуждается светом и испускает свет другой длины волны. Например, вы светите синим, а флуоресценция у вас зеленая.
Во флуоресцентном микроскопе есть источник возбуждающего света, система фильтров и детектор. В итоге многие процессы, которые раньше было невозможно увидеть, теперь стали видимыми. За это нужно сказать спасибо Стефану Хеллу. В 1993 году, работая в Финляндии, в Университете Турку, он придумал, как усовершенствовать флуоресцентный микроскоп.
Исследователь предложил использовать два лазера, направленных на образец. Импульс первого лазера вызывает флуоресценцию молекул, а импульс второго — гасит ее у молекул, находящихся на краях изучаемой области. В итоге по центру получается изображение с большим разрешением. В дальнейшем, сдвигая изучаемую область, можно увидеть изображение всего объекта с превосходящим предел Аббе разрешением.
Статья Стефана Хелла, опубликованная в 1994 году в журнале Optics Letters, обратила на себя внимание других исследователей. Ему предложили работу в Институте биофизической химии Общества Макса Планка в Геттингене, где он мог бы реализовать свои теоретические предположения на практике.
Ученый сделал это к 1999 году, построив особый микроскоп. Его метод известен сейчас под названием «STED-микроскопия» (Stinulated Emission Depletion — микроскопия на основе подавления спонтанного испускания). В 2000 году он опубликовал изображения бактерии Escherichia coli с невиданным ранее разрешением.
Другое направление независимо от Хелла развивали американские исследователи Эрик Бетциг и Уильям Мернер. Они разработали методы одномолекулярной флуоресцентной микроскопии (single-molecule fluorescence microscopy).
Обычно при изучении флуоресценции, в частности при использовании этого явления в микроскопии, мы имеем дело с поглощением и испусканием излучения сразу множеством молекул. В 1986 году Мернер сумел впервые измерить поглощение излучения одной-единственной молекулой. Через 8 лет он сделал следующий шаг в своих исследованиях, занявшись изучением зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP). При этом он обнаружил, что флуоресценцию в одном варианте GFP можно «включать» и «выключать» по желанию.
Когда белок поглощает свет с длиной волны 488 нм, флуоресценция начинается, но спустя некоторое время исчезает. И, независимо от количества света, направляемого на белок, ответного излучения не возникает. Но, если использовать свет с длиной волны 405 нм, то молекула белка снова начинает флуоресцировать.
Схема работы люминесцентного микроскопа.
Так выглядит клетка в тот момент, когда испускает свечение.
Снимки микрообъектов, полученные при помощи флуоресцентной микроскопии.
Мернер распределил эти молекулы GFT в геле так, чтобы расстояние между каждой отдельной молекулой было больше, чем дифракционный предел Аббе. Из-за того, что они были рассеяны столь редко, микроскоп оказался в состоянии регистрировать свечение отдельных молекул. О своей работе Мернер рассказал в журнале Nature в 1997 году.