Итак цели ясны, задачи поставлены. Вот только с реализацией автоселекции штаммов в турбидостате оказалось не все так просто. Очень даже не просто оказалось управлять скоростью роста микроорганизмов в турбидостате действием ингибиторов. Собственно решению этой задачи и посвящена сама диссертация. Хорошо хоть к этому делу, на современном этапе развития техники, можно было приспособить компьютер (см рисунок установки) и соответственно использовать кое-какие математические вычисления.
Рис. 3.1. Структурная схема экспериментальной установки.
1 — стеклянный стакан; 2 — фторопластовая крышка; 3 — активатор; 4 — управляющая мини-ЭВМ; 5 — фото-резистор; 6 — электронная схема предобработки сигнала; 7 — АЦП; 8 — осветитель; 9, 10 — перистальтические насосы; 11 — смеситель; 12 — блок электронных ключей; 13 — буферная ёмкость.
Изобретателю турбидостата, Брайсону, было куда трудней добиться желаемого. Тем не менее достигнутые результаты не впечатляют. Выводы же скорее пессимистичны. И внимательное прочтение диссертации позволило понять почему. Турбидостат в принципе, даже теоретически не годится для автоселекции штаммов, для осуществления эволюции на лабораторном столе. Во-первых, если для нейтрализации действия какого-нибудь ингибитора клетке нужно усиленно производить хоть какое-нибудь соединение, то синтез этого соединения потребует дополнительного расхода биохимической энергии (АТФ). В ущерб других процессов. И как результат скорость роста клеток будет падать. Она может возрасти только если мутации позволят использовать дополнительный источник энергии, присутствующий в среде. А это не всегда возможно. По-видимому не просто так в экспериментах использовались, для питательных сред, соли лимонной кислоты. Ингибирование закислением тоже осуществлялось с помощью лимонной кислоты. Лимонная кислота является участником цикла Кребса, поставляющего энергию клеткам. Но это мелочь. О более серьезной вещи прямо говорится в тексте диссертации: Таким образом, преследуя цель автоселекции штамма, следует производить турбидостатное культивирование в следующих условиях:
1. При больших скоростях роста (для увеличения вероятности появления, мутанта);
2. При малых скоростях скоростях роста, достигнутых действием ингибитора (для увеличения вероятности сохранения мутанта);
3. При непрерывном и линейном снижении скорости роста исходного штамма воздействием ингибитора (для наискорейшего выделения мутанта).
Совместить эти, попарно альтернативные условия, можно только динамически, то есть культура микроорганизмов поочерёдно (на некоторое время) должна попадать в каждое из этих условий.
Мутант, даже если он обладает большой скоростью роста, практически не имеет шансов задержатся в ферментере турбидостата. Медленно растущий мутант — тем более. В самом деле, приведенные расчеты это показывают. Посмотрите внимательно график зависимости вероятности сохранения мутанта от скорости роста. Гамма это отношение скорости роста мутанта к скорости роста нормальных клеток. По оси абсцисс время выраженное в делениях клеток.
Рис. 2.6. Вероятность полного отсутствия вымывания делящегося мутанта.
Как тут не упомянуть о пользе математической биологии. Если бы эти расчеты были сделаны до проведения работы, а не после, то и сама работа возможно не была бы проделана. Проходит то время когда биологи рассуждали на пальцах. Позволю себе еще раз процитировать идею автоселекции в турбилостате впервые высказанную Брайсоном и многократно повторенную в работах разных авторов, занимающихся популяционной микробиологией: Для этого предлагалось увеличивать величину ингибирующего фактора в среде, что должно приводить к частичному или полному снижению скорости роста культуры В целом. Вследствие непременного наличия мутантов в популяции, в ферментёре должно появляться какое-то количество клеток способных расти с большей скоростью. Скорость роста культуры в целом при этом увеличится, что может являться основанием для дальнейшего наращивания величины ингибирующего фактора.