ТЕХНОЛОГИИ
Набор инструментов генного инженера
Илья Кельмансон
Рассказ о работе удивительных молекул, ставших инструментами генных инженеров, будет гораздо понятнее, если рассмотреть какую-нибудь занятную технологическую задачу. Например, поставить перед собой цель создать трансгенную светящуюся мышь. В хозяйстве она вряд ли пригодится, зато у ваших соседей наверняка такой не окажется.
Припомним теорию: вся информация об устройстве нашего организма записана в длиннющих молекулах ДНК, которые состоят из четырех типов нуклеотидов (назовем их А, Т, G и С), последовательно соединенных друг с другом. Каждая клетка организма содержит полный набор ДНК — так называемый геном.
Каждый ген кодирует один белок. Белки тоже являются полимерными молекулами, но в отличие от ДНК они построены не из нуклеотидов, а из двадцати типов аминокислот. Три последовательно соединенных нуклеотида ДНК однозначно кодируют одну аминокислоту белка: например, триплет A-T-G кодирует одну и ту же аминокислоту как у человека, так и у какой-нибудь бактерии. Благодаря такой унифицированности мы можем переносить гены из одного живого существа в другое.
В принципе, любую последовательность нуклеотидов можно синтезировать химически. Однако мы пока не можем сами придумать ген, определяющий нужные нам свойства. Зато мы можем попытаться найти живое существо, обладающее такими свойствами (в нашем случае — способность к флуоресценции), и выделить нужный ген из него. Для этих целей выберем морские кораллы. Обычно их окраска флуоресцентная: если в темноте посветить на живой коралловый риф синей лампочкой (например, из детектора валюты), он засияет всеми цветами радуги. Это светятся так называемые GFP-подобные белки, содержащиеся в кораллах, — среди них есть голубые, зеленые, желтые и красные. Наша задача заключается в выделении из коралла и подготовке к внедрению в мышь гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок.
Для начала необходимо раздобыть живой коралл, убедиться, что под ультрафиолетовой лампой он светится (то есть содержит нужный нам белок), и выделить из него РНК. Как правило, поиск нового гена начинается именно с РНК — она не содержит ненужных нам некодирующих белок участков. Однако в работе с РНК есть свои сложности: в частности, она быстро разрушается специальными ферментами, обильно выделяемыми нашим организмом для защиты от вирусов. Поэтому заранее поставим одноразовые пластиковые пробирки на лед (при низкой температуре ферменты работают хуже) и наденем резиновые перчатки. Кроме пробирок нам понадобятся настольная центрифуга, несколько автоматических пипеток с одноразовыми наконечниками и набор реактивов для выделения РНК.
Аккуратно отщипываем от коралла маленький (чуть больше спичечной головки) кусочек ткани и помещаем в пробирку. В нее же наливаем реагент для разрушения ткани и начинаем теребить кусочек коралла пипеткой. Все надо делать быстро, иначе РНК успеет развалиться. Когда большая часть ткани растворится, начинаем крутить пробирку в центрифуге. Осадок трогать не станем, отберем только жидкость и перенесем ее в другую пробирку.
Теперь мы имеем раствор, в котором содержатся белки, ДНК, РНК и масса других компонентов. Из всей этой смеси нам нужна только РНК. Для разделения (фракционирования) разных классов биологических молекул используется, как правило, изменение их растворимости — например, если добавить в наш раствор спирта и немного соли, большая часть ДНК и РНК выпадут в осадок. Еще раз "прокрутив" пробирку на центрифуге и удалив жидкость, мы получим обогащенный РНК образец. Эту процедуру придется повторять несколько раз, добавляя в смесь разные вещества; в итоге мы избавимся от большинства примесей и получим относительно чистый раствор молекул РНК, часть которых, как мы надеемся, кодирует нужный нам белок.
Для дальнейшей работы уже недостаточно физико-химических методов. Тонкие операции с биологическими молекулами мы будем проводить, используя инструментарий, позаимствованный у природы, а именно ферменты.