В молекулярной биологии применяется множество ферментов, выделенных из разных организмов, — если их поместить в подходящий по составу солевой раствор и добавить все необходимые для реакции компоненты, ферменты заработают в пробирке так же, как и внутри клетки. Выделять нужные ферменты нам не придется, все они продаются специализированными компаниями.
Теперь на основе каждой молекулы РНК мы должны синтезировать соответствующую ей (комплиментарную) молекулу ДНК (кДНК). ДНК более стабильна, а главное, для работы с нею существует гораздо больше методов. Правда, большинство живых существ не умеет строить ДНК по РНК (наоборот, ДНК является матрицей, с которой обычно синтезируется РНК), однако из этого правила есть исключения. Так называемые ретровирусы (к ним относится, например, ВИЧ — вирус, вызывающий СПИД) почему-то выбрали именно РНК для хранения своей наследственной информации. Для размножения ретровирус должен встроить свои гены в геном жертвы, поэтому с вирусной РНК должна сперва считаться ДНК-копия. Такая реакция называется обратной транскрипцией. Ретровирусы "изобрели" для нее специальный фермент, ревертазу, чем сильно поспособствовали прогрессу молекулярной биологии.
Для работы ревертазе требуется так называемая затравка — короткий фрагмент ДНК, заранее прикрепленный к молекуле РНК. Когда ревертаза натыкается на затравку, она "садится" на РНК и ползет по ней в направлении от конца к началу молекулы. При этом ревертаза захватывает из раствора отдельные нуклеотиды и присоединяет их к затравке, тем самым удлиняя цепочку ДНК. РНК при этом играет роль матрицы.
Синтез кДНК мы проведем с помощью набора реактивов SMART, выпускаемого фирмой Clontech (США). Кроме ревертазы и солевого буфера, в котором этот фермент работает, в набор входят также два коротких (длиной около пятидесяти нуклеотидов) фрагмента одноцепочечной ДНК — праймеры. Каждая цепочка синтезированной нами кДНК будет начинаться с одного из этих праймеров и заканчиваться последовательностью нуклеотидов второго праймера. Для чего это нужно, мы скоро узнаем.
У животных все молекулы РНК, кодирующие белок (есть и другие, но сейчас нам это не важно), заканчиваются несколькими десятками идущих подряд нуклеотидов А (поли-А). Благодаря этому мы можем использовать в качестве затравки первый праймер, содержащий комплиментарную последовательность, поли-Т. Присоединяя нуклеотиды к праймеру поли-Т, ревертаза ползет по РНК, синтезируя ее ДНК-копию. Когда ревертаза доходит до самого начала молекулы РНК, происходит еще одно важное для нас событие. Разогнавшийся фермент не останавливается сразу, а достраивает еще три лишних нуклеотида С. Тут в игру вступает второй праймер, до сих пор свободно плававший в растворе. К его концу химически присоединен маленький кусочек РНК, состоящий всего из трех нуклеотидов, G-G-G. Этими нуклеотидами он "прилипает" к свешивающейся с только что синтезированной ДНК последовательности С-С-С, как бы продолжая собой цепочку РНК. Обманутая ревертаза обнаруживает, что матрица еще не кончилась, и достраивает на конце молекулы ДНК последовательность, комплиментарную "прилипшему" праймеру.
Таким образом, мы получили набор одноцепочечных молекул ДНК, комплиментарных РНК коралла, но дополнительно содержащих на концах известные нам нуклеотидные последовательности праймеров (адаптеры). Правда, искать среди этих молекул ген зеленого флуоресцентного белка пока рано, у нас для этого слишком мало материала. Чтобы наработать достаточное количество кДНК, мы воспользуемся одним из самых важных достижений молекулярной биологии — методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Белковые молекулы чрезвычайно сложны как по химическому составу, так и по "механической" конструкции. Белок не сможет выполнять свою функцию "молекулярной машины", если в процессе синтеза цепочка составляющих его аминокислот не будет правильным образом уложена (скомпактифицирована) в пространстве.
Изучение компактификации белков — процесса "окончательной сборки" молекул, выражаясь в терминах машиностроения, — является интереснейшей научной задачей, имеющей бесчисленное множество приложений.
Чрезвычайно важно понять, как осуществляется правильная укладка молекулы, где хранится план укладки и где записан технологический процесс компактификации, представляющей собою последовательность операций, каждая из которых должна происходить в свое время и выполняться над соответствующей частью исходной молекулы.