Отличительной чертой бактерий является то, что часть генетической информации у них содержится в коротких кольцевых молекулах ДНК — плазмидах. Многие биотехнологические компании торгуют очищенными плазмидами (векторами), специально предназначенными для решения разных молекулярно-технологических задач. Нам необходимо купить или попросить у знакомых биологов вектор для экспрессии чужеродных генов в бактериях, вставить в него нашу кДНК и перенести полученную конструкцию в бактерию.
Чтобы все это сделать, мы должны сначала разрезать кольцевую молекулу ДНК вектора. Для этого используются специальные ферменты — рестриктазы, сама реакция называется рестрикцией. В природе рестриктазы используются бактериями для защиты от чужеродной ДНК; генному инженеру набор рестриктаз, хранящийся в морозильнике, столь же необходим, как ножницы портному. Рестриктазы узнают и разрезают строго определенные нуклеотидные последовательности, которые называются сайтами рестрикции. Для каждой рестриктазы есть свой сайт узнавания ДНК, обычно включающий в себя от четырех до восьми расположенных подряд нуклеотидов. Вектора, предназначенные для клонирования, содержат специальный полилинкер — десяток идущих друг за другом разных сайтов рестрикции, перед которым находится промотор — последовательность нуклеотидов, с которой бактерии начинают считывать РНК любого гена.
"Технический контроль" и отбраковку неправильно изготовленных белковых молекул осуществляют опять-таки белки. Обнаруживает дефектные молекулы белок паркин, который "навешивает" на них специальные "бирки" — что-то вроде табличек "Брак!". Эти "бирки" — цепочки молекул убиквитина, прикрепленные к "неисправным" белкам, — являются инициаторами начала работы белковых структур под названием протеосомы.
Протеосомы выполняют функции "баз разделки" (такие существуют на флоте и в авиации), где разбирают на запчасти и режут на металлолом отслужившие свой срок корабли и самолеты. Аналогично "поступают" и протеосомы. Помеченные убиквитином белковые молекулы они "разбирают на запчасти" — деструктурируют до отдельных аминокислот, которые могут быть вновь использованы для "производства" любых других белковых молекул.
Добавим к выбранному нами вектору рестриктазу и подходящий для ее работы солевой раствор (он прилагается к купленному ферменту) и поставим пробирку в термостат, разогретый до 37 °C. Через час все кольцевые молекулы вектора в растворе станут линейными — рестриктаза нашла свой сайт на полилинкере и разрезала в этом месте ДНК. Теперь смешаем разрезанный вектор и кДНК и добавим новый фермент — лигазу. Если рестриктаза играет в нашей работе роль ножниц, то лигаза, наоборот, является иголкой, сшивающей две молекулы ДНК. Спустя несколько часов все молекулы вектора снова станут кольцевыми, но теперь внутри полилинкера в каждой из них будет содержатся по одной молекуле кДНК. Правда, некоторые молекулы вектора "зашились" обратно сами на себя — для борьбы с этим явлением существуют специальные способы, но мы сейчас обойдемся без них, просто возьмем в следующую стадию побольше ДНК и будем надеяться на лучшее.
Мы достигли кульминационной части первого этапа работы — в нашей пробирке находится смесь молекул кДНК коралла, среди которых и ген зеленого флуоресцентного белка. Осталось поместить все эти молекулы в бактерии (такая процедура называется трансформацией) и посмотреть, что получится.
Технически трансформация Е.coli производится очень легко. Достаточно смешать бактерии и вектор, добавить немного солей кальция и пропустить через смесь короткий импульс электрического тока. Некоторые бактерии при этом погибают, с другими ничего не происходит, но многие почему-то "всасывают" в себя ДНК вектора. Почему так происходит, никто не знает, тем не менее все генные инженеры пользуются этим странным свойством Е.coli.
Возьмем стерильный стеклянный шпатель и вотрем трансформированные бактерии в плоские чашки, содержащие питательную среду и антибиотик ампициллин. Используемый нами вектор содержит ген устойчивости к ампициллину, кодирующий специальный фермент, который успевает разрушить молекулы антибиотика до того, как антибиотик убьет бактерию. Таким образом, на нашей питательной среде выживут только бактерии, "проглотившие" вектор, все ^трансформированные бактерии погибнут. Поставим чашки с бактериями на ночь в теплое место, пусть подрастут.