Таким образом, полученные положительные результаты свидетельствуют о необходимости более эффективного внедрения различных приемов получения сомаклональных вариантов в практику селекционной работы, и наиболее реальным является применение сомаклональной изменчивости для улучшения или «доработки» уже существующих сортов или линий по отдельным недостающим признакам.
Несмотря на то, что существует генетическая нестабильность культур изолированных тканей и клеток растений, она не может обеспечить потребности селекционеров в генетическом разнообразии. В связи с этим для ускорения селекционного процесса в культуре клеток используются химические и физические мутагены. Обработка ткани раувольфии змеиной азотистым ипритом в концентрации 2,5∙10-3 М привела к повышению уровня аберраций хромосом в первом пассаже до 32 %, вызвала сдвиг популяции в сторону увеличения триплоидов. В результате удалось получить штамм с более высокой биосинтетической активностью по сравнению с исходной тканью.
Спонтанный и индуцированный мутагенез в культуре клеток, тканей и протопластов позволяет получать растения, представляющие практический интерес для селекционеров. Важное практическое значение имеет создание форм растений, устойчивых к неблагоприятному действию факторов внешней среды, таких как низкие температуры, засоление почв, загрязнение природной среды токсическими веществами, поражение вредителями и возбудителями болезней. Эти факторы могут быть использованы в качестве селективного фона в процессе клеточной селекции.
Клетки, сохранившие при этом жизнеспособность, могут быть регенерированы в целые растения.
Принципиальной разницы в результатах клеточной селекции при спонтанном и индуцированном мутагенезе нет. Для повышения частоты мутаций в соматических клетках обычно используют такие мутагены, как нитрозогуанидин, нитрозометилмочевина, метилметансульфонат. Реже применяют облучение ультрафиолетом, γ-квантами 60Со и нейтронами.
В качестве селективных агентов используют антибиотики, ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, фито- и патотоксины, агенты, вызывающие солевой и водный стресс, аналоги аминокислот и
Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы:
— прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь определенный искомый мутантный тип клеток;
— непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений;
— тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны;
— визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических методов (тонкослойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный анализ, микроспектрофотометрия и др.).
Из перечисленных выше приемов клеточной селекции прямая селекция является наиболее распространенным методом и используется главным образом для выделения растений-регенерантов, устойчивых, например, к гербицидам, антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и другим антиметаболитам.
Виды культур растительных клеток, используемые в клеточной селекции
Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследования.
Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта: медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токсических веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на перечисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным.