В состав вектора кроме всего прочего должен входить маркерный ген, позволяющий селектировать измененные клетки. Часто в качестве селективных используют широко распространенные в природе гены ферментов, модифицирующих антибиотики и инактивирующие их действие.
Особенности организации генома эукариот
У эукариотических организмов механизм регуляции транскрипции гораздо более сложен. В результате клонирования и секвенирования генов эукариот обнаружены специфические последовательности, принимающие участие в транскрипции и трансляции.
Для эукариотической клетки характерно:
1. Наличие интронов и экзонов в молекуле ДНК.
2. Созревание и-РНК — вырезание интронов и сшивка экзонов.
3. Наличие регуляторных элементов, регулирующих транскрипцию, таких как:
а) промоторы — 3 вида, на каждый из которых садится специфическая полимераза. Pol I реплицирует рибосомные гены, Pol II — структурные гены белков, Pol III — гены, кодирующие небольшие РНК. Промотор Pol I и Pol II находятся перед участком инициации транскрипции, промотор Pol III — в рамках структурного гена.
б) модуляторы — последовательности ДНК, усиливающие уровень транскрипции;
в) усилители — последовательности, усиливающие уровень транскрипции и действующие независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК;
г) терминаторы — специфические последовательности, прекращающие и трансляцию, и транскрипцию.
Эти последовательности по своей первичной структуре и расположению относительно инициирующего кодона отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК-полимераза их не "узнает". Таким образом, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем прокариотических регуляторных элементов. Это обстоятельство необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии.
Типы векторов для введения гена в клетку
Существует несколько типов векторов:
Бактериальные плазмиды
Основная масса клеточной ДНК бактерий содержится в хромосоме (в хромосоме Е. coli, например, 4 млн. пар нуклеотидов). Однако кроме хромосом бактерии содержат большое количество очень маленьких кольцевых молекул ДНК плазмид длиной несколько тысяч пар оснований (молекулярная масса от 1,5 до 300 мегадальтон, 1 МД = 1500 п. о). Такие мини-хромосомы называют плазмидами.
Как правило, плазмиды имеют в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, ионам тяжелых металлов (R-плазмиды), а также гены, контролирующие катаболизм некоторых органических соединений (плазмиды биодеградации, или D-плазмиды). Поскольку эти гены находятся в плазмидах, они представлены гораздо большим числом копий. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества ферментов, химически нейтрализующих антибиотики или ксенобиотики, что и обеспечивает устойчивость к последним. Плазмиды, по-видимому, вездесущи, так как их выделяют из разных штаммов и видов бактерий, но не являются обязательными компонентами генома, а в некоторых природных штаммах плазмиды не обнаружены вообще.
Поскольку плазмидная ДНК значительно меньше хромосомной, ее довольно легко выделить в чистом виде. В присутствии ионов кальция плазмиды легко поглощаются бактериями-рецепиентами, даже если те их никогда не содержали, и в клетках бактериального потомства можно обнаружить много копий поглощенной плазмиды. Однако бактериальная клетка обычно может содержать в своем составе плазмиды одного типа. Это явление несовместимости плазмид. Существуют группы несовместимости — Inc-группы (от английского incompatibility — несовместимость). В такой группе может быть несколько плазмид, совместимых между собой, но не совместимых с другими плазмидами. У этих плазмид сходны многие признаки и часто значительна гомология ДНК.
Число копий плазмиды в клетке может существенно варьировать. Это зависит от генетических особенностей как клетки, так и плазмиды. Плазмиды, находящиеся "под ослабленным контролем", могут размножаться до тех пор, пока их количество не достигнет 10-200 копий на клетку. Если же плазмида находится "под строгим контролем", она реплицируется с той же скоростью, что и главная хромосома. Такие плазмиды содержатся в клетке в одной или в нескольких копиях. Естественно, что для клонирования рекомбинантных ДНК стараются использовать плазмиды первого типа. Но это не обязательно, так как плазмиды в присутствии хлорамфеникола могут умножаться независимо от деления хромосомы, и количество копий плазмиды может многократно увеличиваться.