Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой также необходима стерилизация оборудования.
Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кг культуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.
Посевной материал может быть трёх видов:
— культура, выросшая на твердой питательной среде;
— споровый материал;
— мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.
В три этапа получают и посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1–1.5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап — аналогично, но в колбах, третий — в сосудах с 500 г среды.
Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую структуру среды. Для повышения активности ферментов к отрубям можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром при помешивании (температура — 105–140 °C, время 60–90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36–48 часов.
Рост делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28 °C), затем рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55–70 %).
Выросшая в неподвижном слое при поверхностном культивировании культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу размельчают до гранул 5–5 мм. Культуру высушивают до 10–12 % влажности при температурах не выше 40 °C, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют прямо в неочищенном виде — в кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.
Схема очистки сводится к следующему:
— освобождение от нерастворимых веществ;
— освобождение от сопутствующих растворимых веществ;
— фракционирование (как правило, хроматографическими методами).
Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген — вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6–8 % влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности.
Стандартизация ферментного препарата — доводка активности фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители — крахмал, лактоза и др.
Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.
Препараты, производимые для сельского хозяйства, делятся на 3 группы:
— энтомопатогенные препараты;
— бактериальные удобрения;
— антибиотики.
Отечественное биотехнологическое производство выпускает 3 группы энтомопатогенных препаратов:
1. Бактериальные препараты на основе Bacillus thuringiensis — энтобактерин-3, дендробациллин, инсектин, токсобактерин.
2. Грибной препарат боверин на основе гриба Beauveria bassiana.
3. Препараты на основе вирусов ядерного полиэдра (вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС и ДР.).
Все микробные патогены выпускаются в виде смачивающих порошков, паст, реже — гранул, эмульсии спор и кристаллов. При непосредственном применении предполагается использование различных добавок в виде растворителей, прилипателей, способствующих повышению их эффективности. Технология получения бактериальных энтомопатогенных препаратов. Наибольшее распространение среди промышленно выпускаемых микробных патогенов получили бактериальные препараты. Их отличительными особенностями являются высокая вирулентность по отношению к насекомым-вредителям, безопасность для окружающей флоры и фауны, достаточно высокая скорость воздействия на вредителей и др. В настоящее время производятся препараты против более 160 видов насекомых.