Для крупных частиц с радиусом большим, чем размер двойного электрического слоя, подвижность частиц близкого состава не зависит от их размеров, что затрудняет разделение больших молекул при электрофорезе, поскольку скорость перемещения молекул ДНК и белков, денатурированных ДДСН, в чистом растворителе идентична. Разделение достигается лишь тогда, когда миграция обусловлена молекулярно-ситовым эффектом (например, в гелях).
В то время как электрофорез обусловливает разделение частиц с различной подвижностью, электроосмос определяет течение буферного раствора в электрическом поле.
В большинстве случаев при капиллярном электрофорезе на электрофоретическое перемещение ионов накладывается ЭОП. Этот поток зависит от распределения зарядов вблизи поверхности капилляра. Почти все поверхности несут на себе определенный заряд. В случае кварцевых капилляров — это отрицательные заряды, обусловленные диссоциацией силанольных групп. Этот поверхностный заряд локализуется в жидкости напротив соответстующих противоионов с противоположным зарядом. В таком двойном электрическом слое, схематически изображенном на рис. 3, преобладают положительные ионы, которые распределены между неподвижными и подвижными слоями.
Рис. 3. Разделение зарядов па поверхности кварца и образование ξ-потенциала.
Если параллельно поверхности капилляра приложено электрическое поле, то оно притягивает противоионы из подвижного слоя вдоль оси и засасывает жидкость в капилляр. Поэтому в случае кварцевых капилляров электроосмотический поток направлен к катоду. Образуется очень плоский профиль потока. Это приводит к значительно меньшему уширению пиков, чем при гидродинамическом течении, при котором образуются сильно зависящие от радиуса капилляра и скорости течения параболические профили потока — профили Хагена-Пуазейля (рис. 4).
Рис. 4. Профиль ЭОП, обусловленный давлением (а), и идеальный профиль (Ь).
В капиллярах, загруженных стеклянными шариками или частицами силикагеля, ЭОП не должен зависеть от диаметра частиц, и направление потока в загруженном капилляре должно быть таким же, как и в пустом. При этом нет необходимости в применении очень маленьких частиц (с диаметром около 1 мкм или даже меньше) или длинных колонок, как при хроматографических методах. Поэтому метод ЭХ вызывает все возрастающий интерес, так как он сочетает селективность ВЭЖХ с высокой разделительной способностью КЭ. Благодаря применению непористых частиц можно исключить влияние диффузии в поры на уширение полос или пиков.
Величина ЭОП может быть упрощенно описана с помощью так называемого уравнения Гельмгольца.
u = ε∙E∙ξ/4∙π∙η
Она пропорциональна диэлектрической проницаемости ε, напряженности приложенного поля Е и количеству зарядов на стенке капилляра или возникающему при этом ξ-потенциалу и обратно пропорциональна вязкости электролита η. В кварцевых капиллярах ЭОП уменьшается при увеличении концентрации электролита и добавлении органических компонентов и возрастает с увеличением степени диссоциации поверхностных силанольных групп, что означает увеличение ЭОП с возрастанием значений pH (рис. 5).
Рис. 5. Зависимость электроосмотического потока от pH.
Условия: внутренний диаметр капилляра 75 мкм, L = 40/47 см, буфер: фосфат 10 мМ, нейтральный маркер: бензиловый спирт: Е = 425 В/см.
Если же при добавлении катионных поверхностноактивных веществ (ПАВ) к разделительному буферу на поверхности капилляра адсорбируется положительный заряд (см. рис. 6), то ЭОП меняет направление и переносит разделительный буфер в направлении анода.
Рис. 6. Адсорбция катионных ПАВ на стенке капилляра.
Зависимость ЭОП в кварцевых капиллярах от значений pH и соответствующая воспроизводимость подвижности представлены на рис. 5. ЭОП проявляет при циклическом обмене буферов типичный эффект гистерезиса. Наибольшие отклонения наблюдаются в средней области pH при значениях, близких к значению рН кремневой кислоты. Благодаря увеличению времени кондиционирования в зависимости от изменений значений pH буфера удается несколько уменьшить это отклонение, и явления гистирезиса уменьшаются. Для воспроизводимости работ с незагруженными капиллярами необходимо при обмене буферов стандартизовать время заполнения и кондиционирования с тем, чтобы можно было устранить явление гистерезиса ЭОП.