Условия разделения: L=50/57 см; внутренний диаметр — 75 мкм; буфер — 5 мМ динитробензойная кислота, 0.5 мМ ЦТАБ (цетилтриметиламмонийбромид) pH 9.0;Е=-431 В/см; детектирование — непрямое, УФ 214 нм; проба — карбоновые кислоты по 25 ррм каждой.
Из-за локальных воздействий на поверхностный потенциал кварца следует ожидать дополнительного изменения профиля потока, который отклоняется от идеальной "поршнеобразной" формы, что также способствует уширению полос. Особенно отчетливо можно наблюдать это явление в пробах, содержащих многозарядные положительные ионы. Вследствие повышения концентрации буфера ионообменное взаимодействие между пробой и силанольными группами подавляется, благодаря чему анализ становится возможным.
Особенно важным становится подавление адсорбции на стенках при разделении белков с помощью КЭ. В этом случае можно показать, что уже повышение емкостного отношения (как меры адсорбции на стенках) с 0.001 до 0,1 приводит к росту высоты эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ) с 0.5 мкм до 15 мкм.
При повторных вводах растворов, содержащих белок, часто наблюдается изменение времени выхода. Для раствора проблема решается в основном двумя различными способами. Согласно первому можно связать ковалентно с поверхностью капилляра гидрофильный слой, второй состоит в возможности добавления к разделительному буферу веществ, которые препятствовали бы ионному обмену.
В представленном на рис. 17 примере разделения белков ионообменное взаимодействие между стенками капилляра и молекулами белка подавляется введением в буфер добавок ДАП (1,3-диаминопропана). Из-за экранирующего действия ДАП пик лизоцима при повышении концентрации ДАП всегда симметричен, и при этом даже возрастает высота пика.
С улучшением симметрии пиков, обусловленным малой адсорбцией на стенках, сильно уменьшается разбавление веществ и пик становится выше. Поэтому снижения границы обнаружения можно добиться не только улучшая детектирование, но также в значительной мере за счет сокращения уширения полос. Этот пример ясно показывает, что только для пиков с высокой интенсивностью (малым разбавлением) достигается низкий порог обнаружения.
Из-за высокой концентрации добавок электропроводность буфера становится такой большой, что для разделения белков можно применять поле только небольшой напряженности, что ведет к удлинению времени анализа.
Устранение адсорбции на стенках будет более подробно описано в разделе, посвященном разделению белков.
5.5. Перегрузка системы разделения
Явление перегрузки наблюдается тогда, когда в систему разделения вводится слишком большое количество пробы. Так как в КЭ нет стационарной фазы, а разделительный объем ограничивается несколькими мкл, легко наступает явление перегрузки. Прежде всего, к перегрузке может привести неправильная регулировка прибора или слишком большая концентрация пробы. В качестве рабочего правила можно принять, что пробой может быть заполнено максимум 1–2 % от объема капилляра. Для капилляра длиной 50 см это соответствует максимальной длине зоны пробы 10 мм.
Рис. 17. Уширение полос из-за, адсорбции на стенках…
Условия: капилляр — 50 мкм; 42/50 см; поле — 300 В/см; буфер — 50 мМ фосфат, 20 мМ сульфат лития, 10–50 мМ МП; pH 3.5, ввод пробы давлением, 1 с.; детектирование — 214 нм; проба -0,5 мг/мл лизоцим.
Наряду с объемной перегрузкой в случае слишком больших времен ввода при высокой концентрации пробы наблюдается также перегрузка по массе. Перегрузка по массе отчетливо видна при рассмотрении зависимости значения Н от концентрации пробы. При равном времени ввода проб увеличивается только количество введенной пробы, а не ее объем. Доля σVU как вклада в уширение полос остается при этом постоянной. В качестве примера на рис. 18 показан эффект перегрузки из-за большого объема и высокой концентрации пробы.
Время ввода пробы повышается с 1 до 5 с, так что, хотя порог обнаружения и понижается примерно до 0.2 мМ, одновременно возрастает значение Н, поэтому вклад перегрузки по объему увеличивается. Отсюда видно, что вкладом перегрузки по объему в уширение полос пренебречь нельзя Даже при маленькой концентрации в области, в которой можно пренебречь перегрузкой по массе, значение Н остается при вводе пробы за 5 с больше, чем при вводе за 1 с.
Низкий порог обнаружения при вводе больших объемов пробы нивелируется сильным уширением полос (таблица 4) и связанными с этим трудностями разделения соседних пиков.