Рис. 22. Схематическое представление электрического разделения пробы. I1, I2, I3 соответствуют потокам в различных частях капилляра; n1 соответствует количеству пробы перед ее разделением; n2 - введенное и n3 - оставшееся количества пробы.
6.3.5. Эффекты обогащения при вводе пробы (стэкинг)
Проблемы, связанные с воспроизводимостью ввода пробы при КЭ, обусловлены, кроме всего прочего, небольшой разницей в давлении и коротким временем ввода пробы. Большие вводимые объемы при нормальных условиях очень быстро уменьшают эффективность разделения за счет перегрузки по объему. Поэтому пытаются вводить большие объемы и концентрировать зоны перед разделением. Это удается за счет использования различных эффектов перед собственно разделением с помощью КЗЭ. Эффекты концентрирования получаются, если работают с негомогенными буферными системами. В простейшем случае проба вводится из чистого водного раствора. Из-за различия в электропроводности между раствором пробы и буфером проба сначала ускоряется в сильном поле до границы между буфером и раствором пробы, но затем замедляется после входа в область буфера с пониженной напряженностью поля. Этот эффект уже был показан на рис. 21 и при электрокинетическом вводе пробы описан как "электростэкинг".
В качестве альтернативы раствору непосредственно перед вводом пробы в капилляр вводится "водяная пробка". Падение напряжения в непроводящей электричество воде так велико, что следующая зона пробы концентрируется при имеющемся там существенно более высоком напряжении. При этом степень концентрирования доходит до 100 (см. рис. 23).
Рис. 23. Разделение РТН-аргинина и РТН-гистидина.
А) электрокинетический ввод из буфера; В) электрокинетический ввод из воды; С) электрокинетический ввод из воды с "водяной пробкой" между пробой и буфером.
При "электростэкинге", однако, концентрация молекул пробы во время процесса ввода падает на входе в капилляр до достижения равновесного состояния. Это будет представлять проблему для ионов с малой подвижностью, поскольку в этом случае допустимая длина вводимой зоны пробы будет превышена прежде, чем будет достигнуто равновесное состояние. В этом случае достигается очень незначительное концентрированно пробы. ЭОП также играет при "электростэкинге" важную роль. Если ЭОП и направление перемещения ионов ориентированы одинаково, это также будет мешать концентрированию пробы. При вводе пробы на входе в капилляр образуется зона, которая обладает очень малой электропроводностью. При увеличении подвижности ЭОП она будет формироваться быстрее и возможность "электростэкинга" сужается.
При миграции пробы против ЭОП нужно различать два случая: если μell >> μЭОП, то возможно получение хороших результатов; при μell > μЭОП проба не может быть введена.
Резюмируя, можно сказать, что при нормальной полярности прибора КЭ (выход заземлен) и направленном к катоду ЭОП могут концентрироваться положительно заряженные молекулы пробы, в то время как при противоположном поле при вводе пробы концентрируются анионы.
Еще эффективнее может концентрироваться проба, если поле после гидродинамического ввода прикладывается на короткое время в противоположном направлении. При условии, что ионы, которые нужно определять, перемещаются в направлении против ЭОП, капилляр может заполняться раствором пробы почти до детектора (гидродинамический ввод), и раствор пробы может удаляться из капилляра исключительно за счет инверсии полярности. Одновременно ионы, перемещающиеся против ЭОП, могут концентрироваться в пограничном слое между раствором пробы и разделительным буфером. Прежде, чем этот пограничный слой достигнет входа в капилляр, с помощью переполюсовки источника напряжения может начинаться собственно разделение. Точный момент времени для переполюсовки можно установить, следя за изменением тока, так как ток в процессе концентрирования постоянно увеличивается. Причина этого в том, что зона раствора пробы (с высоким сопротивлением) удаляется из капилляра, Когда сила тока достигает примерно 90 % от максимального значения (капилляр заполнен только разделительным буфером), то источник напряжения может переполюсовываться и молекулы пробы, удерживаемые в узкой зоне вблизи входа капилляра, разделяются. На рис. 24 показаны отдельные стадии этого способа ввода, который в целом называется "стэкинг" с обращением поля. Из-за большого вводимого объема ионы пробы концентрируются примерно тысячекратно. Недостатком метода является то, что при слишком поздней переполюсовке часть ионов пробы выходит из капилляра, и что могут анализироваться только либо анионы, либо катионы.