6.5. Детектирование
При детектировании в КЭ компоненты пробы проходят через часть капилляра, в которой происходит детектирование в режиме реального времени или детектируются на конце капилляра в режиме с разделением времени. При этом, в отличие от хроматографии, необходимо обратить внимание на то, что через детектор пробы движутся с различными скоростями.
6.5.1. Уф-детектирование
Большинство аппаратурных требований не в последнюю очередь относятся к детектированию, так как при детектировании непосредственно в колонке УФ-поглощение происходит в слое очень малой толщины. Несмотря на это, наиболее часто применяемыми детекторами для измерения УФ-поглощения являются детекторы, применяемые в ВЭЖХ. Из-за очень малой толщины слоя (средняя величина внутреннего диаметра капилляра) к детекторам предъявляются высокие требования, касающиеся чувствительности, шумов, влияния светорассеяния и т. д. Для того, чтобы избежать потери эффективности из-за смешивания вне капилляра, детектирование осуществляют прямо в капилляре.
Типичная ширина зоны в капилляре находится в пределах 5 мм (N = 500000), что соответствует объему 10 нл (капилляр диаметром 50 мкм). Этот крайне малый объем является также причиной очень высокой чувствительности по массе, часто встречающейся в рекламе. Мировым рекордом является в настоящее время порог обнаружения в 300 молекул при отношении сигнал/шум три к одному для аминокислот и индуцируемой лазером флуоресценции. Для рутинного применения, однако, более важна концентрационная чувствительность. Она более чем скромна из-за короткого пути поглощения (средний диаметр капилляра).
При УФ-детектировании в КЭ концентрационная чувствительность в 30-100 раз ниже, чем в ВЭЖХ. Это зависит для поперечно облучаемых капилляров от шумов детектора и эффективной толщины слоя, которая отличается от номинальной (равной диаметру капилляра) в сторону уменьшения. Заметно мешает также частичное светорассеяние из-за несовершенной фокусировки (свет стенок капилляра) и неидеальной цилиндрической формы капилляра. Оптимизацией оптики (щель, линза и т. д.) можно в основном исключить эти эффекты. Очень трудной оптимизацию оптики УФ-детекторов для КЭ делает также полное внутреннее отражение. На рис 25 показаны рассчитанные световые пути для различных апертур диафрагмы и капилляров.
Рис. 25. А) апертурная диафрагма шириной 50 мкм, капилляр с внутренним диаметром 50 мкм и внешним диаметром 350 мкм; В) апертурная диафрагма шириной 145 мкм, капилляр с внутренним диаметром 50 мкм и внешним диаметром 350 мкм; С) апертурная диафрагма шириной 350 мкм, капилляр с внутренним диаметром 50 мкм и внешним диаметром 350 мкм; D) с линзой, капилляр с внутренним диаметром 75 мкм и внешним диаметром 275 мкм; Е) с линзой, капилляр с внутренним диаметром SO мкм и внешним диаметром 350 мкм.
Большинство фирм-производителей применяют поэтому или фокусирующие системы линз, которые освещают область капилляра примерно в 0.5 нм и меньше, или щели, которые имеют ширину от 50 до 200 мкм и длину от 100 до 300 мкм.
Существует много примеров улучшения чувствительности при УФ-опредёлении в КЭ за счет увеличения толщины слоя детектирования Чтобы увеличить толщину слоя и снизить границу обнаружения, были протестированы различные экспериментальные разработки.