При оптимизации анализа необходимо находить компромисс между воспроизводимостью и эффективностью. Если требуется количественно проанализировать пробу, то для получения надежных результатов следует работать с концентрациями, превышающими границу обнаружения по крайней мере от 10 до 20 раз. Только при оптимальных условиях удается получить хорошую эффективность и высокую воспроизводимость площадей пиков в пределах от 1.5 до 3 %.
Эти опытные данные хорошо совпадают с характеристиками, приводимыми фирмами-производителями и опубликованными результатами.
Воспроизводимость, таким образом, зависит от многих индивидуальных факторов. Сравнительные измерения на различных приборах КЭ в разных лабораториях показывают, что методы являются принципиально переносимыми, однако точность анализа колеблется от 1 до 2.5 %. Эти испытания отчетливо показывают, что при оценке индивидуальных ошибок большее внимание следует обращать на те из них, которые вызваны аппаратурой и методом.
Зонный электрофорез является самым простым из описанных здесь способов разделения. Так как многие методы анализа, которые будут обсуждаться ниже, основаны на КЗЭ, необходимо детально рассмотреть его основные принципы. При зонном электрофорезе буфер, значение pH, а также напряженность поля во всем пространстве разделения остаются постоянными. Пробы разделяются за счет их различных подвижностей. Они вводятся в виде отдельной зоны на входе в капилляр и обнаруживаются в виде дискретных, отделенных друг от друга зон на конце детектора. Назначение буфера при этой технике разделения — поддерживать постоянное значение pH и обеспечивать транспортный поток. Выбор pH буфера определяет заряд ионов пробы. Концентрация буфера влияет на ЭОП. Для дальнейшей оптимизации могут использоваться добавки к буферу.
Рис. 35. Схема КЗЭ:
а) начальное состояние, б) различная миграция отдельных зон образцов, в) профиль напряженности поля (сплошная линия) и pH (пунктирная линия) в сечении разделительной камеры.
1.1. Влияние pH
Влияние pH на перенос пробы к детектору объясняется двумя причинами. Как уже отмечалось, на разделение, основанное на электрофоретической миграции, в большей или меньшей степени накладывается ЭОП, на величину которого влияет диссоциация поверхностных силанольных групп. Кроме того, подвижность ионов определяется их степенью диссоциации в несущем электролите и, следовательно, его значением pH. Поэтому можно оптимизировать разделение изменением величины pH и вида буфера. Наибольшее различие в способности к перемещению для слабых электролитов, т. е. наивысшую селективность получают тогда, когда значение pH буфера лежит между значением pKs компонентов пробы (Ks — константа диссоциации). Это поведение аналогично разделению в ионнообменной хроматографии.
Рис. 36. Зависимость подвижности двух слабых кислот от значения pH.
Достижимое разрешение двух пиков можно рассчитать по соотношению:
R = 2(t2 — t1)/(w1 + w2)
где t — время миграции и w — ширина пика у его основания.
Переходя к уравнению и рассчитывая время миграции из подвижностей, получим:
Наилучшее разрешение получается, когда ионы движутся против ЭОП. Высокое напряжение также приводит к улучшению разрешения. Рис. 37 показывает рассчитанное разрешение пары пиков. Пик 2 перемещается при этом с подвижностью 0.5 см2/кВс, а пик 1 — с подвижностью, составляющей от 0 до 30 % от минимальной, в поле 300 В/см в капилляре длиной 50 см (D=10-5 см2/с-1).
Рис. 37. Разделительная способность R двух пиков в зависимости от ЭОП и разницы подвижностей.
Недиссоциированные компоненты пробы движутся через капилляр со скоростью ЭОП. ЭОП зависит, как было показано, также от pH и других свойств электролита, особенно от ионной силы. Возможности, которые появляются из-за наложения электрофоретического перемещения и ЭОП, можно продемонстрировать на примере разделения нуклеотидов. Если ЭОП направляется к катоду, нуклеотиды движутся к аноду, причем наиболее быстро движется трифосфат благодаря наиболее высокому заряду.