Как можно показать с помощью теоретических выкладок, использование ионов буфера с большими молярными коэффициентами экстинкции приводит к более чувствительному детектированию. Молярный коэффициент экстинкции в УФ-спектре имидазола в максимуме при 205 нм составляет 5000. Имидазольный буфер можно использовать в области от 190 до 220 нм для непрямого детектирования, т. е. область применения ограничена нижней УФ-областью. Вследствие того, что многие вещества также поглощают в УФ-области, при детектировании могут возникать помехи. Расширение области непрямого детектирования в сторону более высоких длин волн и/или в область более щелочных значений pH достигается 4-аминопиридином (4-АП). В максимуме поглощения при 205 нм 4-АП обладает молярным коэффициентом экстинкции 15500, при 245 нм — около 15600. При 254 нм существует еще один пик с экстинкцией около 14000. Это примерно в три раза больше, чем молярный коэффициент экстинкции имидазола при 214 нм. Подвижность 4-АП примерно такая же, что и у имидазола. Преимущество 4-АП проявляется в том, что ом применим в более широкой области длин волн — даже при 270 нм можно проводить непрямое детектирование. Кроме того, буфер 4-АП можно использовать до значений pH 10.1 без уменьшения чувствительности буферной системы вследствие исчезновения заряда 4-АП.
В таблице 19 приведены другие буферные системы, применяемые для разделения катионов с непрямым детектированием. По подвижностям ионов пробы можно выбрать подходящий разделяющий буфер. Значения pKs берутся из литературы или определяются титрованием.
Соответствующие УФ-спектры важнейших буферных компонентов представлены на рис. 51.
Рис. 51. УФ-спектры буферных веществ, которые можно применять для непрямого детектирования катионов. УФ-спектры веществ, протонированные уксусной кислотой, получены на детекторе Perkia Elmer LC 480 Diodea Array.
Воспроизводимость разделения в ионной аналитике при применении буферных систем очень хорошая. ОСО времен миграции лежат ниже 0.5 %, воспроизводимость площади пика — важнейшая величина для количественных анализов — лучше 2.3 %. Наряду с точностью для количественных расчетов важной величиной является их достоверность, которая подтверждается данными других методов. В качестве альтернативных методов измерения выступают атомно-абсорбционный анализ, ИОХ, а также ионный анализ с ионно-селективными электродами. Как показывают некоторые примеры, результаты, полученные различными методами анализа, в пределах известных допустимых отклонений совпадают. Определение щелочных и щелочноземельных катионов в байкальской воде показано на рис. 52.
Рис. 52. Разделение катионов в воде, взятой с поверхности озера Байкал.
Условия: прибор КЭ: Millipore Waters Quanta 4000; капилляр: 75 мкм, 54/60 см; поле: 446 В/см; буфер — 5 мМ имидазол/серная кислота, pH 4.5; ввод пробы гидростатический, 30 с. Непрямое детектирование, 214 им. Проба — байкальская вода: 1 — калий, 2 — натрий, 3 — кальции, 4 — магний. Количественные результаты приведены в таблице 20.
Для подтверждения полученных результатов эти же пробы воды изучали методами ИОХ, а также атомно-абсорбциомной спектроскопии (ААС).
При этом в методе ИОХ анализ пробы проводили по циклической схеме с применением синтетического ионита с детектором по электропроводности, а анализы методом ААС — по стандартному методу Шинкеля. Между найденными концентрациями ионов наблюдалось хорошее согласие.
В качестве другой пробы, для которой имелись в наличии контрольные данные, полученные другими аналитическими методами, изучали воду из лесного родника. Для минеральной воды лесного источника результаты анализов, полученные всеми тремя методами, приведены в таблице 20. Дополнительно здесь же приведены концентрации ионов, имеющиеся на этикетке бутылок с этой водой.
Более проблематичен анализ катионов в крови. Размеры красных кровяных шариков составляют 7:5x2 мкм и граничат с размерами частиц, которые можно вводить в КЭ без проблем. После разжижения свежей крови в 100 раз эта проба уже не в состоянии коагулировать. Красные и белые кровяные тельца крови не допускают прямого ввода пробы в методе ВЭЖХ. Содержание белков в этих разжиженных растворах всегда выше 0.7 г/л, так что белки составляют существенную часть пробы. Несмотря на это, разделение катионов методом КЭ вследствие их очень высокой подвижности по сравнению с компонентами пробы не представляет большой проблемы.