Рис. 58. Разделение стандартных белков в различных буферных системах.
Условия: прибор самодельный с быстросканирующим детектором, капилляр 50 мкм, 37/44 см, поле: 341 В/см; ввод пробы гидродинамический, 15 см, 2с; детектирование 214 нм; буфер фосфатный; проба: цитохром С, лизоцим, ри-бонуклеаза А.
Повышение pH от 2.4 до 4.7 при концентрации буфера 25 мМ приводит к явному уменьшению интенсивности пика, в то время как при повышении концентрации свыше 50 мМ (pH 4.3) до 100 мМ (pH 4.2) наблюдается заметное увеличение интенсивности пика.
И для этих буферов с высокой концентрацией можно улучшить проявления пика уменьшением значения pH до 2.9. Однако в данном случае, вследствие крайне высокой подвижности протонов (кислые значения pH), резко увеличивается ЭОП.
Поэтому дальнейшая оптимизация в сторону более кислых значений pH удается только с одновременным разбавлением разделяющего буфера, которое вызывает уменьшение интенсивности пика, Кроме того, работа в очень кислой области (pH 2.3) приводит к уменьшению селективности. Этот способ оптимизации разделения стандартных белков показан на рис. 58.
9.1.2. Добавление солей к буферу
В основе взаимодействия белков со стенкой лежит в основном механизм катионного обмена. Это возможно, поскольку и в случае отрицательного полного заряда молекулы (особенно при основных pH) всегда имеются в наличии катионные группы, например аргинин-радикалы в цепочках полипептидов. Поэтому путем добавления солей щелочных металлов (например сульфата калия) к буферу, как и в случае ионообменной хроматографии, достигается конкуренция кулоновскому притяжению и вызванное этим притяжением взаимодействие белок — стенка явно уменьшается. Следуя этой концепции, можно для стандартных белков в широкой области pi (pi 5-11) достичь эффективности 50000-100000 тарелок на метр. И в этом случае недостатком является сравнительно высокая электропроводность буфера (эффективное охлаждение!) которая вынуждает использовать поля низкого напряжения (5 кВ) и длинные капилляры с маленьким внутренним диаметром (25 мкм). Кроме того, большие ионные силы уменьшают как ЭОП, так и ξ-потенциал пробы, что вместе с вышеназванными факторами приводит к длительным временам анализа.
В качестве буферных веществ могут служить также цвиттерионные молекулы (внутренние соли), которые обладают большой буферной емкостью, но не вносят значительного вклада в общую электропроводность системы. Цвиттерионы могут образовывать ассоциаты с белками и поверхностью капилляра и, тем самым, уменьшать адсорбцию белков. За счет применения аминосульфоната, аминосульфата и, в последнее время, фосфонийсульфоната в очень высоких концентрациях в качестве добавок к фосфатному буферу в нейтральных условиях можно разделять как основные, так и кислые белки.
9.1.3. Добавка органического модификатора к буферу
Недостаток заключается в возможной денатурации белка.
9.1.4. Применение буферных добавок для разделения белков (динамическое наполнение капилляров)
Простейший метод модифицирования поверхности кварцевого капилляра состоит в добавлении к буферному раствору такого компонента, который предпочтительнее адсорбируется на поверхностных силанольных группах. Формирование такого адсорбционного слоя дополнительно влияет на ЭОП и уменьшает адсорбцию вследствие гидрофобного или электростатического отталкивания. Разделяющие системы, применяемые в основном для разделения белков в немодифицированных капиллярах, приведены в таблице 22.
Добавка ПАВ ведет, прежде всего, к увеличению эффективности разделения белков. При этом взаимодействия между молекулами различных ПАВ и пробами могут быть очень различными. С одной стороны, можно конечно обсуждать, вопрос адсорбции детергентов на биомолекулах. Следствием этого является улучшение растворимости и увеличение гидрофильного характера пробы. Наряду с этим, большую роль играет также адсорбция ПАВ на стенках капилляров. Это приводит как к увеличению гидрофильности поверхности, так, и к возможной блокировке адсорбционных центров.
При использовании катионных детергентов, например, ЦТАБ, формируется двойной электрический слой, в котором положительные заряды направлены внутрь капилляра. Тем самым достигается обращение ЭОП. Вследствие того, что поверхность заряжена положительно, адсорбция катионных белков тормозится электростатическим отталкиванием от стенки. При этом в случае основных белков достигается большое число ступеней разделения и симметричность пиков. Вообще следует обращать внимание на то, чтобы добавленным детергентом не превысить критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ).