Неионные ПАВ, например BRIJ 35, также могут быть использованы для уменьшения взаимодействия белок-стенка. Для еще большего увеличения адсорбции этих детерегенов на поверхности капилляра и полного подавления ионных взаимодействий с силанольными группами, стенка обрабатывается дополнительно условно "толстым" покрытием С 18.
Принципиально должна существовать также возможность использования в КЗЭ испытанного в классическом электрофорезе и в жидкостной хроматографии анионного ПАВ ДДСН. Однако в систематических исследованиях кислых белков оказывается, что добавка ДДСН в количествах от ррт до одного процента к пробе и к буферу приводит к очень неопределенным результатам. В общем случае не улучшается ни эффективность, ни селективность, а даже наблюдается некоторое ухудшение этих характеристик. Возможным объяснением этого может быть хорошо известное действие денатурации, оказываемое ДДСН на белок. Наряду с этим, в наблюдаемой потере селективности большую роль играет, конечно, адсорбция ПАВ на биомолекулах и связанное с этим появление заряда пробы. Первоначальная структура заряда белков может полностью исчезнуть или перекрываться этим эффектом, так что разделение в электрическом поле произойдет только лишь по адсорбированным зарядам детергентов.
Рис. 59. Катионные ПАВ.
Этот эффект был использован в ДДСН-ПААГ-электрофорезе для определения ММ белков. Этот же способ может быть реализован в капилляре и позже будет описан в главе "Капиллярный гелевый электрофорез".
Резюмируя, можно отметить, что в случае добавок детергентов для разделения белков в КЭ многообещающим представляется использование в качестве динамических покрытий в основном неионных ПАВ, т. к. они лишь незначительно изменяют структуру заряда пробы. Конечно, этот метод включает совместное действие химического модифицирования поверхности и динамического покрытия, в результате чего преимущества доступности и простоты применения буферных добавок в конце концов теряются.
Неблагоприятную адсорбцию белков на поверхности капилляра можно уменьшить также добавками низших полиаминов, например, 1,3-ДАП. При этом получают высокую эффективность, однако из-за большой собственной электропроводности буфера следует использовать электрические поля низкой напряженности. Действие буферных добавок, вероятно, частично объясняется необратимой адсорбцией на стенках капилляра. Поэтому одновременно со снижением адсорбции пробы происходит резкое уменьшение электроосмоса. В качестве примера на рис. 60 показано разделение стандартных белков.
9.2. Использование капилляров с модифицированной поверхностью
ЭОП можно регулировать также с помощью химического модифицирования поверхности капилляра. Одновременно с этим могут уменьшаться возможная адсорбция компонентов пробы на поверхности капилляра и улучшаться воспроизводимость анализов. Для химического покрытия капилляров можно использовать различные способы. Химически модифицированные капилляры коммерчески доступны.
Рис. 60. Разделение стандартных белков в буферной системе ДАП.
Условия: капилляр 75 мкм, 37/44 см, поле: 272 В/см; детектирование: 214 нм, фосфатный буфер со 100 мМ ДАП, pH 3.0; проба: цитохром С, лизоцим, рибонуклеаза А.
9.2.1. Типы покрытий поверхности в КЭ
Принципиально различаются два метода нанесения слоев на поверхность. Сначала использовали метод традиционной химии силанов, при котором моно-, ди-, или трисиланы присоединяются к силанольным группам на стенках капилляров с образованием силоксановых связей. Функциональные группы, введенные сначала поверх силанов, можно использовать еще и на второй стадии для окончательного модифицирования поверхности.
Перечень описанных к настоящему времени в литературе т. н. общепринятых типов покрытий, приведен в таблице 23. Основным ограничением метода является недостаточная стабильность силоксановых связей по отношению к гидролизу в щелочных условиях. Этот метод достаточно хорошо известен в жидкостной хроматографии.
