Пример разделения белков (А) с помощью покрытия АПФ; (В) — в капилляре из плавленного кварца; буфер — 200 мМ КС], pH 1; пробы: L — лизоцим, D — ДМСО, R — РНК крупного рогатого скота, Т — трипсиноген, WM — миоглобин кита, НМ — миоглобин лошади, НСА-В — карбоксиангидраза В человека, ВСА-В — карбоксиангидраза крупного рогатого скота.
9.3.1.3. Гидрофильные гидрокоил- и полиэфирные покрытия
Изготовление. В ЖХ для разделения белков в основном используются гидрофильные фазы, например, с диол-полиэтиленгликолем (ДПЭГ) или полисахаридами. Кварцевые капилляры также можно модифицировать этими функциональными группами.
В данном случае для синтеза используются двухступенчатые реакции, на первой стадии которых применяют, например, глицидсилан. Он может впоследствии либо гидролизоваться диолом, либо соединиться с глицерином или полиэтиленгликолем (рис. 64). Нанесение углеводородов происходит на первой стадии с помощью аминофункци-ональных групп, с которыми впоследствии можно связать мальтозу с использованием, например, циано-боргидридного катализа.
Рис. 64. Схема синтеза ПЭГ-покрытия.
Электроосмос и стабильность. При покрытии диолом и полиэтиленгликолем (ПЭГ), как и ожидалось, электроосмос резко уменьшается. (В случае диола mэоп=0.1 см2/кВс для 50 мМ фосфата и pH 6). Рабочая область для таких капилляров ограничивается значениями pH от 3 до 5. Долговременная стабильность в этих условиях достигает нескольких месяцев. При покрытии мальтозой возможна работа в области pH от 3 до 7. Вследствие того, что при нанесении аминосиланов с мальтозой реакции обмена подвергаются не все функциональные аминогруппы, при низких значениях pH поверхность заряжается положительно.
Это приводит к обращению направления ЭОП в кислотах. Кроме того, хранение капилляров в этом случае возможно только при добавлении консервантов, защищающих покрытие от повреждения микроорганизмов.
Применимость: Покрытия на основе диола, ПЭГ и мальтозы в основном используются для разделения белков в КЭ. Разделение стандартных белков показано на рис. 65.
Рис. 65. Разделение белков в капилляре, покрытом ПЭГ.
Буфер: 30 мМ фосфат, pH 3.8; пробы: 1 — цитохром С, 2 — лизоцим, 3 — миоглобин, 4 — трипсин, 5 — РНК, 6 — трипсиноген, 1 — химотрипсиноген.
В заключение можно отметить, что и в случае гидрофильных покрытий капилляров или на первой стадии синтеза введенной "подложки" поверхность покрывается недостаточно плотным слоем, так что зачастую взаимодействия поверхности с пробой подавляются не полностью.
9.3.1.4. Покрытия на основе белков
Изготовление. Внутренние стенки капилляров можно покрыть не только углеводородами, но и белками, например, альфа-лактальбумином. Для того, чтобы свободные альдегидные группы служили центрами связи с белками, в капилляре, модифицированном аминогруппами, сначала проводится реакция обмена с глутардиальдегидом. Впоследствии эти группы реагируют с введенным в капилляр белком.
Электроосмос. Покрытия на основе белков показывают интересную зависимость ЭОП от pH. Вследствие того, что белки имеют амфотерные свойства, выше своих значений pi они существует в анионной, а ниже — в катионной формах. Если значения pH буфера соответствуют значениям pi, то белки незаряжены. Следовательно, в этой точке электроосмос должен падать до нуля, или, соответственно, менять направление на противоположное при переходе через эту точку. Таким образом, в принципе существует возможность подбором определенного белка или амфотерных молекул регулировать силу и направление ЭОП.
9.3.2. Полимерные покрытия
9.3.2.1. Покрытия на основе линейных полиакриламидов
Поперечносшитые полиакрилимидные гели оказались прекрасными носителями и разделительными матрицами для электрофоретического разделения белков в способах, основанных на плоском слоевом электрофорезе, таких как ДИСК-электрофорез, ДДСН-ПААГ-электрофорез или ИЭФ. Это указывает на гидрофильный характер таких гелей, которые проявляют только слабые взаимодействия с биомолекулами. В КЭ возможно также покрытие кварцевой поверхности акриламидом.
Изготовление. В двухстадийной реакции стенка капилляра сначала обрабатывается гаммаметакрилоксипропилтриметоксисиланом в разбавленной уксусной кислоте.