Нанесенные таким способом виниловые группы на второй стадии реакции сополимеризуются в водном растворе с акриламидом В качестве радикального инициатора реакции служит персульфат аммония, а катализатором является N,N,N’,N’-тетраметиленэтилендиамин (ТМЭД) (рис. 66).
Рис. 66. Схема, образования полиакридамидного покрытия.
Электроосмос и стабильность. ЭОП полностью подавляется при покрытии поверхности капилляра линейным полиакриламидом. Стабильность таких капилляров при низких pH (до 3) очень высокая, однако в щелочной среде при рН>8 они нестабильны. Эта нестабильность проявляется в постепенном появлении ЭОП, а также колебаниях времени миграции проб.
Применимость. С учетом простоты производства, а также доступности приобретения покрытия на основе линейных полиакриламидов нашли широкое применение. В первую очередь речь идет не только о разделении белков, но и некоторых биомолекул — таких, как фрагменты ДНК.
На рис. 67 показано разделение стандартных проб при pH 2.8. Несмотря на заметно возросший ЭОП, можно работать с нормальными полями, так что разделение заканчивается примерно через 5 минут.
Рис. 67. Разделение стандартных белков при проверке стабильности капилляра, покрытого полиакриламидом.
Буфер: 30 мМ цитрат, pH 2.8; пробы: А — лизоцим, В — РНК. С — химотрип-синоген.
Вследствие того, что покрытия на основе линейных полиакриламидов позволяют полностью подавить ЭОП, можно перенести такой классический способ разделения, как ИЭФ, на КЭ.
В области биологически важных проб наряду с белками определенную роль играют также нуклеотиды, олигонуклеотиды и фрагменты ДНК. Такого рода пробы в КЭ до настоящего времени разделяли методом МЭКХ, а также полиакриламидгелевым КЭ. Покрытия на основе линейных полиакриламидов в сочетании с макромолекулярными буферными добавками можно привлечь для разделения фрагментов радикалов ДНК в широкой области.
Использование покрытых капилляров для этих целей представляется вполне выгодным, поскольку проблемы, связанные с использованием капилляров, заполненных гелем (образование пузырей, воспроизводимость и стабильность гелей) еще не решены. Наконец, капилляры, покрытые линейными полиакриламидами, можно использовать также для изготовления гельзаполненных капилляров.
9.3.2.2. Покрытия на основе поли(винилпирролидона)
Капилляры, покрытые поли(винилпирролидоном) (ПВП) успешно применяли для разделения белков методами гельпроникающей эксклюзионной хроматографии (ГПХ) и хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) в ВЭЖХ. Применению ПВП в качестве покрытия уделяется внимание также в КЭ.
Изготовление. На первой стадии на стенку капилляра наносится виниловое покрытие. На заключительной стадии проводят сополимеризацию с 1-винил-2-пирролидоном в водном растворе с использованием ТМЭД в качестве катализатора и персульфата аммония как радикального инициатора реакции.
Свойства и применимость. Оптимальная рабочая область для такого типа покрытий для разделения белков приходится на область сильных кислот, в которой капилляры сохраняют стабильность в течение нескольких недель. На рис. 68 показано разделение 15 (!) стандартных белков в области р! от 4.5 до 11 (!) и ММ от 12000 до 77000. Эффективность достигает 700000 теоретических тарелок в течение 25 минут. Покрытия на основе ПВП для кварцевых капилляров являются высокопроизводительными и при использовании в области, кислотных pH вполне конкурируют с покрытиями на основе линейных полиакриламидов.
Рис. 68. Пример разделения белков в капилляре с ПВП-покрытием.
Буфер: 58.5 мМ фосфат, pH 2.0; пробы: А — бэта-лактогдобулин В, В — бэта-лактоглобулин А, С — лизоцим, D — серумальбумин человека, Е — РНК крупного рогатого скота, F — цитохром С, G — трипсиноген, Н — миоглобин кита, I — трансферрин, J — кональбумин, К — миоглобин лошади, L — карбоксиангидраза В, М — карбоксиангидраза А, N — гемоглобин, О — парвальбумин.
9.3.2.3. Покрытие капилляров поли(этиленимином) (нанесение ионных слоев)
Поли(этиленимин) (ПЭИ) является положительно заряженным полимерным покрытием, которое закрепляется на стенке капилляра под действием электростатических взаимодействий.