На этом рисунке показаны кассетный экзон (вставляемый в одни изоформы и отсутствующий в других), альтернативный акцептор, альтернативный донор, далее интрон может либо вырезаться, либо не вырезаться.
Теперь вернемся к вопросу о человеке и мыши. Человек и мышь биологически очень похожи. Белки похожи — уровень сходства аминокислотных последовательностей 80 %, также похожа значительная часть некодирующих областей генома. Практически у всех генов одинаково устроена экзон-интронная структура, для 99 % генов экзонная структура одинакова. Только 1 % генов уникален у каждого генома, остальные гены имеют гомологи в другом геноме. Интересен тот факт, что при таком относительно невысоком уровне различий человека от мыши внешне отличают легко. А два вида мухи дрозофилы вряд ли кто-то различит на глаз, хотя генетически они различаются сильнее, чем человек и мышь.
Возникает вопрос: Если геномы одинаковы, то может быть, и белки одинаковы? Непонятно, чем же человек отличается от мыши. Одинаково ли устроен альтернативный сплайсинг у мыши и человека?
Наивный подход для ответа на этот вопрос такой: возьмем весь набор альтернативного сплайсинга мыши и человека и сравним его. Этот подход неправильный, так как при исследовании альтернативного сплайсинга мы здесь имеем дело с EST. Если у человека EST просеквенировано несколько миллионов штук, то у мыши сделано всего несколько тысяч, поэтому там, где мы можем увидеть альтернативный сплайсинг у человека, можем ничего не увидеть у мыши, так как базы данных еще не совсем полные. Поэтому такое сравнение даст нам неправильный ответ.
Правильный подход в данной ситуации заключается в следующем: мы на основе имеющихся данных на человеческой ДНК строим мРНК, соответствующую белку, и затем этот белок проецируем на мышиный геном. Если оказывается, что для этого белка (или его части) нет кодирующих последовательностей в мышиной ДНК, то это значит, что тот экзон, который есть у человека, отсутствует в геноме у мыши.
Возьмем человеческие и мышиные гены, происходящие от общего предкового гена. Возьмем такие пары генов-ортологов, сделаем сравнение. Мы получим некоторую выборку, среди которым 50 % генов человека имеют такие изоформы, которых нет у мыши, то же самое и с мышью.
Сравним пары генов человек-мышь. Например, ген бета-глобина человека и мыши — такие гены, разошедшиеся в процессе эволюционного видообразования, называются ортологами. Выборку мы взяли не очень большую, в ней присутствовали гены, имеющие альтернативный спалйсинг. И оказалось, что у 52 % человеческих генов есть такие экзоны, которых нет у мыши. И половина мышиных генов имеет такие изоформы, которых нет у человека.
Но нам могут сказать — вы использовали EST, это неточные данные. Если мы возьмем полноразмерные мРНК (а данные по ним гораздо точнее, хотя общее количество сиквенсов по ним меньше), и проведем с ними ту же процедуру, то окажется, что примерно треть генов человека имеет изоформы, которые в геноме мыши не кодируются, отсутствуют, и также в геноме человека отсутствуют мышиные экзоны.
А вот конкретные примеры: сверху изображены ДНК и ее изоформы у человека, а снизу — то же у мыши. Например, для белка р53, который участвует в регуляции клеточных процессов (раковое перерождение, апоптоз). Видно, что у мыши есть изоформа, которая теряет экзон, порождая стоп в другом месте.
Представленные данные показывают, что альтернативный сплайсинг — явление весьма распространенное, и что мышь сильно отличается от человека по альтернативному сплайсингу. Можно сделать и эволюционное предположение. По-видимому, альтернативный сплайсинг допускает большую свободу для создания новых белков, или изменения функций существующих белков, и в этом и состоит его связь с эволюцией.
Некоторые методы молекулярной биологии
Д.В. Ребриков
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.