Всю известную информацию можно объединить в следующую схему, включая ступенчатое восстановление через диимид и гидразин (рис. 20). Биохимия нитрогеназы окончательно неясна до тех пор, пока не будут описаны реакции на молекулярном уровне. Недостаточно изучено, как энергия от гидролиза АТФ сочетается с переносом электронов к нитрогеназе, как происходят комплексование и восстановление молекулы азота, не до конца ясен механизм участия в этом процессе металлов, в том числе молибдена. Потребность в молибдене у фиксирующих атмосферный азот видов азотобактера намного больше, чем у видов, использующих нитраты в качестве источника азота.
В состав симбиотических азотфиксирующих систем помимо фермента нитрогеназы входят и другие металлсодержащие белки бактероидов и тканей клубенька.
Mo Fe
\ /
S
+ Mo Fe —► Мо \ /
S
1,46
2NH.+Mo Fe
\/
S
~MoNH2H3NFe
23^NH—NH2n^ *Мо^“2,9 —4,1—►Fe-
Рис. 20. Схема ступенчатого восстановления азота через диимид и гидразин
(Харди, 1970)
Особенно следует отметить роль железосодержащего белка — леггемоглобина в механизме симбиотической фиксации молекулярного азота. В отличие от фермента нитрогеназы, находящейся внутри клубенька в бактероидах, леггемоглобин локализуется в растительных клетках. В клубеньках он образуется как продукт симбиоза бактерий с высшими растениями. Активность азотфик-сации связана с концентрацией леггемоглобина в клубеньках. В инокулированных неэффективным штаммом Rhizobium клубеньках леггемоглобин отсутствует.
Основная функция леггемоглобина сходна с функцией гемоглобина позвоночных животных и заключается в обратимом присоединении кислорода. Леггемоглобин, являясь переносчиком кислорода, не принимает непосредственного участия в восстановлении азота. Благодаря наличию этого пигмента, с одной стороны, бактероиды обеспечены кислородом, с другой стороны, сохранены анаэробные условия для работы нитрогеназы. Нитрогеназа очень чувствительна к кислороду и инактивируется им; в то же время для образования энергии АТФ, необходимой для процесса азотфиксации, требуется кислород. Механизм защиты нитрогеназы от кислорода весьма сложен, и леггемоглобин, по-видимому, является лишь одним из многочисленных звеньев в данном процессе.
Предполагают, что у анаэробных азотфиксаторов существует несколько механизмов защиты нитрогеназы от кислорода. Так, очень высокий уровень дыхательной активности у азотобактера является своеобразной системой защиты от инактивации кислородом.
Другой возможный путь — «конформационная защита нитрогеназы» (пространственное изменение белкового компонента нитрогеназы в присутствии молекулярного кислорода). Кроме того, происходит создание частичного анаэробиоза вследствие симбиоза с неазотфиксирующим компонентом.
Большой интерес представляют выделенные из азотфиксирующих организмов корриноиды — соединения группы витамина В12, содержащие кобальт. Интерес к этим веществам возник в связи с установлением факта абсолютной необходимости кобальта для симбиотически выращиваемых бобовых на питательных средах, лишенных азота, а также факта положительного влияния кобальта на активность фиксации азота. В клубеньках корриноиды присутствуют и в клубеньковых бактериях (бактероиды), и в растительной ткани клубенька, куда они экскретируются бактероидами.
Относительно биохимической роли витамина В!2 в азотфиксации известно немного. В ряде работ показано, что соединения группы В, 2 входят в состав двух ферментов — метил мал онил-КоА-мутазы и рибонуклеотидредуктазы (рис. 21, табл. 56).
| Вещества | Эффективныйштамм | Неэффективныйштамм |
| Витамин В,2 в клубеньках люпина, ммкг/г | 65 | 45 |
| Кобамидные коэнзимы в клетках Rhizobium meliloti, тыс. ммоль/г | 25,5 | 6,7 |
| Гемоглобин в клубеньках фасоли (по данным Шемахановой), мг/г сухой массы | 95 | 68 |
| Дезоксирибонуклеиновая кислота в клубеньках люпина, мг/г | 0,04 | 0,016 |
Производные витамина В12 катализируют большое количество реакций, в которых осуществляется перенос водорода между двумя смежными углеродными атомами с одновременным перемещением других групп в противоположном направлении.
К настоящему времени уже сложилось вполне определенное представление о процессах, происходящих в биохимических системах при фиксации молекулярного азота. Однако необходимо дальнейшее изучение биологических восстановителей азота, промежуточных продуктов фиксации, локализации этого процесса и его структурной организации. Проблема фиксации молекулярного азота комплексная: она затрагивает микробиологию, агрономическую и биологическую химию, физику и химию, молекулярную биологию, а также молекулярную генетику.