В ноябре 1561 года великий князь Литовский и король Польский Сигизмунд II Август подписал с Готхардом Кетлером, ландмейстером Тевтонского ордена в Ливонии, так называемую «Виленскую унию», ознаменовавшую распад Ливонской конфедерации.
В соответствии с этим документом, на части земель Ливонского ордена образовывалось светское государство — Герцогство Курляндское и Семигальское во главе с Кетлером в качестве герцога, который признавал себя вассалом Великого княжества Литовского, а остальная, большая часть территории Ливонии, напрямую отходила Великому княжеству Литовскому.
Северная часть Ливонии с центром в Ревеле (ныне Таллин) к тому времени уже перешла под власть Швеции.
Произошедший раздел Ливонии лишь углубил взаимные противоречия между Великим княжеством Литовским, Швецией и Русским государством.
Проведённые в начале 1562 года русско-литовские переговоры к заключению перемирия не привели. Более того, Сигизмунд Август вёл переговоры с крымским ханом Девлетом I Гиреем, чтобы тот осенью-зимой 1562 года вторгся в земли Русского царства. Всем этим реализация русских претензий на Ливонию была поставлена под сомнение. Разрешить все противоречия и неопределённость в вопросе принадлежности Ливонии мог решающий военный успех.
Выбор Полоцка как объекта такого решающего удара вполне очевиден.
Полоцк в XVI веке был крупнейшим и богатейшим городом Великого княжества Литовского, здесь русская армия могла рассчитывать на огромную добычу.
Кроме того, взятие Полоцка давало целый ряд тактических преимуществ. Полоцк нависал над южным флангом группировки русских войск в Ливонии и создавал угрозу отсечения их от внутренних районов Русского государства. При установлении контроля над Полоцком и течением Западной Двины Русское государство получило бы возможность для прямого сообщения с Ливонией из Смоленска по удобному речному пути.
Потеря Полоцка Великим княжеством Литовским создавала непосредственную опасность для Вильны. Помимо военно-стратегической составляющей, Полоцкая земля наряду с Киевом издревле считалась Рюриковичами одной из своих главных вотчин, отторгнутых Литвой.
Русской армией числом более 30 тысяч человек командовал лично Царь Иван IV. Полоцк был взят в осаду 30 января 1563 года, а уже 15 февраля город капитулировал. При этом армия Великого княжества Литовского под командованием Николая Радзивилла, которая насчитывала не более 3 тысяч человек, помочь защитникам Полоцка не пыталась, а после падения города отступила к Вильно, ожидая продвижения русских войск в направлении столицы Литвы.
Три дня спустя Иван Грозный вступил в покоренный город.
На побежденных посыпались милости и опалы. Так, польскому гарнизону из почти 500 человек был обеспечен почётный свободный отход с развёрнутыми знамёнами. Более того, командиры-ротмистры получили богатые дары в виде соболиных шуб, подшитых драгоценными тканями. По-видимому, поляки в глазах Ивана были всего лишь врагами, честно служившими своему государю, в то время как литовцы, подобно ливонцам, стали изменниками, поднявшими руку на своего вотчинника.
Репрессии не коснулись городских жителей православного вероисповедания — а именно они составляли большинство населения Полоцка.
Не трогали и большинство католиков, хотя, по ходившим в Литве слухам, вошедший в Полоцк отряд служилых татар вырезал попавшихся им под руку монахов-бернардинцев.
Некоторые русские летописи, а также польский хронист Мацей Стрыйковский и его компиляторы сообщают, что еврейскому населению города под страхом смерти было приказано креститься в православие, а не согласившиеся были утоплены в Западной Двине. Но так ли это было на самом деле, неизвестно.
Некоторая часть горожан, в первую очередь высшие литовские сановники-католики, была уведена в Москву в плен, их выкупили и обменяли в 1566–1567 годах. Немецкий авантюрист Генрих Штаден, позже ставший опричником, писал, что часть из полоцких пленников была продана в рабство в Персию и другие мусульманские страны, но подтверждений этому нет.
В Великом княжестве Литовском и Польском королевстве были потрясены падением Полоцка.
Сейм, который в те дни проходил в Пётркове, был прекращён после известий о взятии города. Сигизмунд Август немедля сообщил Николаю Радзивиллу о своём возвращении в Великое княжество Литовское для организации обороны и приказал не вступать в прямой бой с русскими войсками, а в конце февраля между Россией и Литвой было заключено перемирие.