Но, разумеется, Франциск I, которого в плену принудили отказаться от герцогства Миланского, отказался от него лишь временно. Едва он получил свободу, восстановил свою власть и силу, как снова обратил взор на Италию. И чтобы укрепить свои притязания при римском дворе, он женил сына Генриха, ставшего дофином после смерти своего старшего брата Франциска, на племяннице папы Климента VII Екатерине Медичи.
На беду, когда подготовка к вторжению, задуманному королем, была закончена, папа Климент VII умер, и его преемником стал Александр Фарнезе, возведенный на престол св. Петра под именем Павла III.
Павел III решил в своей политике не подпадать ни под влияние императора, ни под влияние короля Франции и не вмешиваться в дела Карла V и Франциска I.
Император больше не опасался папы, его уже не тревожила подготовка Франции к войне, и он, в свою очередь, стал готовиться к походу на Тунис. Поход был успешен, и Карл V, потопив четыре корабля Солимана, торжественно вошел в Неапольскую гавань.
Там он получил сведения, ободрившие его еще больше: оказалось, Карл III, герцог Савойский, дядя Франциска I с материнской стороны, расторг союз с королем Французским по совету своей молодой жены Беатрисы, дочери португальского короля Эммануэля. Поэтому, когда Франциск I на основании своих прежних договоров с Карлом III потребовал у герцога согласия на ввод французских войск в Савойю, тот ответил отказом; таким образом, Франциск I был вынужден предпринять труднейший поход через Альпы, а ведь прежде он считал, что, по милости его союзника и родственника, Савойя для него открыта.
Карл V, уверенный в своей безопасности, был как громом поражен развернувшимися событиями. По повелению короля Франциска I войска вступили в Савойю с небывалой стремительностью, и герцог, еще не ведая о своем поражении, увидел, что провинция занята врагом. Полководец Брион захватил Шамбери, появился на высотах Альп и стал угрожать Пьемонту в тот час, когда Франциск Сфорца, потрясенный успешным продвижением врага, скоропостижно умер, оставив Миланское герцогство без наследника, что не только облегчало задачу Франциска I, но и давало ему новые права.
Брион высадился в Италии и завладел Турином. Заняв город, он расположился лагерем на берегах Сезии и стал выжидать.
Карл V перебрался из Неаполя в Рим. После победы, одержанной им над заклятыми врагами христианства, он с триумфом вошел в столицу католического мира. Триумф опьянил императора, и, вопреки своему обыкновению, он потерял чувство меры: обвинил перед консисторией Франциска I в ереси, сославшись на то, что король покровительствует протестантам, что он заключил союз с турками. Затем, припомнив все старые ссоры, в которых, по его мнению, Франциск I был зачинщиком, он поклялся вести беспощадную войну против зятя.
После всех своих бед Франциск I стал настолько же осторожным, насколько прежде был неосмотрительным. Увидев, что ему угрожают войной и Испания, и Империя, он приказал Аннебо охранять Турин и отозвал Бриона, поручив ему только охрану границы.
Все те, кто знал рыцарски смелый характер Франциска I, не поняли, отчего король отступил, и вообразили, что он отступил потому, что заранее считает себя побежденным. Эта молва заставила Карла V возгордиться еще больше; он стал во главе своей армии и решил вторгнуться во Францию с юга.
Последствия этой попытки известны: город Марсель, оказавший сопротивление коннетаблю Бурбонскому и Пескеру — двум величайшим полководцам того времени, без труда отразил натиск крупнейшего политического деятеля, но плохого полководца. Карл V не стал упорствовать; он обошел Марсель и решил двинуться на Авиньон. Но Монморанси расположился неприступным лагерем между реками Дюране и Роной, и Карл V тщетно старался его одолеть. После полутора месяцев бесполезных попыток он был отброшен; его теснили с флангов, угрожали отрезать с тыла, и он отдал приказ отступать, что весьма сильно походило на беспорядочное бегство. И, чуть не попав в плен, он с большим трудом, без войска и без денег наконец достиг Барселоны.