Образующиеся в результате концы двутяжевых ДНК на жаргоне генетических инженеров называются «липкими». Взаимно комплементарные однонитевые фрагменты таких концов могут вновь сойтись, восстановив двуспиральную структуру за счет межцепных водородных связей. Тем самым они очень облегчат работу другому ферменту – лигазе, которая восстановит валентные связи в обеих цепях, разорванные рестриктазой.
...Опять к вопросу о периодическом возрождении шуток (в том числе изо) и анекдотов. Вспомните, сколько раз вам попадалась на глаза картинка: двое рабочих кончают укладывать асфальт, двое других с отбойными молотками в руках нетерпеливо поторапливают:
– Кончайте скорее, нам нужно прокладывать теплотрассу!
Шутка, конечно, незамысловатая; может быть, ни один даже средневзыскательный редактор не пустил бы ее на страницы своего издания, да беда в том, что это скорее даже и не шутка вовсе, а почти фотографическая зарисовка с натуры. Каждый из нас, увы, мог бы привести сколько угодно примеров в подтверждение, как говорится, жизненности подобной ситуации. Что поделать, не знает иной раз левая рука какого-то там управляющего, директора или предрайисполкома, что делает правая.
Не таким ли точно образом, может возникнуть вопрос, поступает и клетка? Сначала, видите ли, один фермент разрезает ДНК-овую спираль, затем другой – опять сшивает. Одно все-таки дело – головотяп-управляющий, другое – живая клетка, о мудрой согласованности процессов, которые в ней протекают, написано так много. Отвечу кратко: никакого сходства здесь нет. И те, и другие ферменты работают не бесконтрольно, а весьма согласованно; назначение их как раз и заключается в том, чтобы обеспечить обмен генетическим материалом обоих родителей в пределах одной хромосомы.
У бактерий такой способ обмена – вообще единственная возможность наделить потомка признаками обеих родительских форм сразу. Весь генетический материал бактерии организован в виде единственной кольцевой хромосомы – плазмиды; половой процесс у бактерии заключается в переносе фрагмента одной хромосомы в другую.
Если обе нити двутяжевой ДНК обрываются вместе, а не ступенькой, такие концы в отличие от «липких» называются «тупыми». Есть и ферменты, сшивающие два тупых конца, однако эта процедура реализуется труднее. Если генетическому инженеру требуется сшить два фрагмента ДНК, обладающих «липкими», но некомплементарными концами, – он использует синтетический переходник, или «линкер», – небольшой кусочек двойной спирали с соответствующими «липкими» концами.
Методы избирательного разрезания и сшивки двутяжевых нитей ДНК – лишь часть средств из арсенала генетической инженерии. Чтобы «пришить» в определенном месте фрагмент ДНК, соответствующий аминокислотной последовательности интересующего нас белка, нужно этот фрагмент иметь. В некоторых случаях (сравнительно короткие белки) это удается сделать методами химического синтеза. Можно также попытаться выделить соответствующие фрагменты ДНК из клетки, в которой происходит синтез соответствующего белка, но осуществить это практически очень трудно: содержание ДНК слишком мало. Кроме того, в геноме высших организмов участки, кодирующие аминокислотную последовательность некоторого белка, перемежаются вставками-интронами. После синтеза соответствующей молекулы информационной РНК происходит ее созревание – удаление интронов. В клетках же бактерий, которые почти исключительно используются для получения белков методами генетической инженерии, созревание РНК не происходит и, соответственно, не может быть получена нужная аминокислотная последовательность.
Поэтому наибольшее распространение получили методы ферментативного синтеза искомых фрагментов ДНК на матрице соответствующей информационной РНК, выделенной из клеток, продуцирующих нужный белок. Такой процесс, как упоминалось, называется обратной транскрипцией и осуществляется ферментом ревертазой. Чтобы ревертаза могла начать такую работу, ей нужен затравочный фрагмент ДНК – короткий участок, комплементарный началу молекулы информационной РНК.
Таким образом, получается однонитевая ДНК, «достройка» второй, комплементарной цепочки осуществляется с помощью той же ревертазы или ДНК – полимеразы. Также и здесь необходима затравка – олигонуклеотид, комплементарный начальному участку.
Но вот ген, кодирующий аминокислотную последовательность белка, получен. Если, однако, его поместить теперь в клетку, он скорее всего просто будет уничтожен ферментами, да если и уцелеет (это бывает в некоторых случаях), не будет вовлечен ни в процессы репликации, ни транскрипции. Чтобы он мог участвовать в этих процессах, необходимо встроить его в более протяженную последовательность, включающую специфический участок, ответственный за процесс репликации, – репликатор. Кроме того, отбор клеток, продуцирующих чужеродный белок, удобнее производить не путем контроля содержания самого белка, часто это затруднено технически, а по присутствию какого-нибудь сцепленного с ним фактора – фермента или антибиотика.