В хроматине центрального домена центромер у дробянковых дрожжей большая часть гистона H3 замещена ортологом CENP-A, известным как Cnp1 (рис. 6.46) (Takahashi et al., 2000). Откладка CENP-ACnp1 может происходить зависимым от репликации образом в фазе S или независимым от репликации способом в G2 (дополнительные детали см. в главе 13). Кинетохорные белки сами управляют локализацией и сборкой CENP-ACnp1 специфически в пределах центрального домена центромеры (Goshima et al., 1999; Takahashi et al., 2000; Pidoux et al., 2003). Ams2 (фактор GATA), например, управляет связанной с репликацией откладкой CENP-ACnp1 в фазе S. В его отсутствие независимая от репликации откладка с помощью Mis6 в G2 может обеспечивать компенсацию, доводя уровни CENP-ACnp1 до максимума в интерфазе (Chen et al., 2003; Takahashi et al., 2005). Если структура хроматина CENP-ACnp1 разрушается (как в случае мутантов cnpl, mal2, mis6, sim4 и других), специфический «смазанный» паттерн, получаемый при обработке ми-крококковой нуклеазой, превращается в паттерн, более типичный для основной массы хроматина (т.е. в нуклеосомную «лесенку»). Мутанты, затрагивающие хроматин центрального домена, не оказывают никакого заметного влияния на сайленсинг во внешних повторах (Cowieson et al., 2000; Jin et al., 2002; Pidoux et al., 2003; Hayashi et al., 2004). Более того, тот факт, что CENP-ACnp1, Ма12, Mis6, Sim4 и другие кинетохорные белки связываются только с центральным доменом, показывает, что центральный кинетохорный домен является структурно сложным и функционально отличается от «молчащего» хроматина внешних повторов (рис. 6.26).
Были протестированы не все белки кинетохорного домена, но создается впечатление, что сайленсинг в центральном домене является результатом сборки интактного кинетохора, который, как и у S. cerevisiae, включает по меньшей мере 50 белков (Measday and Hieter, 2004). Этот крупный комплекс белков предположительно ограничивает доступ РНК-полимеразы II к репортерным генам, помешенным в этот район, и тем самым тормозит их транскрипцию. У таких мутантов, как cnpl, mal2, mis6 и sim4, при пермиссивной температуре целостность кинетохора, несомненно, частично нарушена, и это делает возможной увеличенную транскрипцию репортерных генов. Побочный результат этого состоит в том, что в норме «молчаший» репортерный ген был использован для тестирования дефектов в хроматине центрального кора, что привело к идентификации новых кинетохорных белков (Pidoux et al., 2003).
Рис. 6.4. «Молчащий» хроматин в ядрах S. pombe
Два интерфазных ядра с гетерохроматином (центромеры, теломеры и «молчащие» локусы mat2-mat3), декорированных красной флуоресцентной иммунолокализацией Swi6, и кинетохорный хроматин (только центромеры), декорированный зеленой флуоресцентной иммунолокализацией CENP-ACnp1. Красные сигналы не в самом соседстве с зелеными представляют теломеры или mat2-mat3. Все нентромеры собраны в кластер на периферии ядра рядом с организующим центром митотического веретена
Центромерные районы не полностью лишены генов, и любопытно, что несколько генов тРНК находятся между внешними повторами и центральным кинетохорным районом (рис. 6.2а) (Kuhn et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Недавно было показано, что они действуют как барьер, предотвращая вторжение гетерохроматина в центральный домен (Scott et al., 2006).
1.4. Центромерные внешние повторы без посторонней помощи делают возможной сборку «молчащего» хроматина
Зависимый от Clr4 «молчащий» хроматин собирается не только в центромерах, но и над районом размером около 20 т.о., содержащим «молчащие» локусы типа спаривания (mat2-mat3) (Noma et al., 2001) и соседствующим с терминальными теломерными повторами (консенсус TTACAGG), добавляемыми теломеразой (Nimmo et al., 1994, 1998; Allshire et al., 1995; Kanohetal., 2005). Район cenH (т.е. гомологичный центромере), который находится "Между mat2 и mat3, имеет большое сходство, свыше ~7 т.о., с внешними повторами, обнаруживаемыми в центромерах (Grewal and Klar, 1997). Кроме того, по крайней мере 0.5 т.о. нуклеотидных последовательностей ДНК, имеющих >84 % идентичности с повторами cenH, могли бы действовать в cis-конфигурации, осуществляя сборку «молчащего» хроматина.
Сборка зависимого от Clr4 «молчащего» хроматина происходит даже на соседних маркерных генах, когда центромерный внешний повтор (dg) или нуклеотидные последовательности mat2-mat3 (cenH) вставляются в районы генома, где в норме сайленсинг не происходит («эктопический» сайленсинг; рис. 5) (Ayoub et al., 2000; Partridge et al., 2002; Volpe et al., 2003). Простое объяснение могло бы заключаться в том, что связывающиеся с ДНК белки узнают эти повторы и, когда связываются, эти белки рекрутируют HDACs и HKMT Clr4, результатом чего является метилирование H3K9, связывание хромодоменных белков и формирование гетерохроматина. Однако ситуация на самом деле еще более сложная. Теперь известно, что центромерные внешние повторы транскрибируются. Замечательно, что эта транскрипция приводит к образованию двухнитчатой РНК (dsRNA) — субстрата для RNAi-машинерии, — а она затем рекрутирует Clr4 HKMT для включения сборки «молчащего» хроматина (Volpe et al., 2002; Sadaie et al., 2004). RNAi также действует на родственные повторы cenH, обнаруживаемые в районе mat2-mat3 и в повторах TAS в теломерах (Cam et al., 2005; Kanoh et al., 2005).