Фенотипические последствия утери функции Ago1, Dcr1 или Rdpl сходны с таковыми у мутантов swi6: пониженное содержание H3K9me2 и потеря сайленсинга над внешними повторами центромер (рис. 6.36). Однако у мутантов по RNAi были выявлены перекрывающиеся некодирующие РНК-транскрипты (ncRNA) дискретной величины, происходящие с центромерных внешних повторов. Эти ncRNA гомологичны естественно встречающимся малым РНК, называемым короткими интерферирующими РНК (siRNAs; ~21 н.), которые изолированы и секвенированы у S. pombe (Reinhart and Bartel, 2002; Cam et al., 2005). Эти siRNAs генерируются Dicer (компонентом RNAi) посредством расщепления двунитчатых дериватов гомологичных некодирующих транскриптов длинного центромерного повтора [mediated by cleavage of the double-stranded derivatives of the long centromere repeat homologous noncoding transcripts].
Хромодоменный белок Chp1 также оказывается компонентом машинерии RNAi. Chp1 связывается с хроматином H3K9me2 и необходим для сайленсинга репортерных генов во внешних повторах центромер, но он также требуется и для генерации siRNAs, гомологичных центромерным повторам (Noma et al., 2004), и для нормальных уровней метилирования H3K9 на центромерных повторах (Partridge et al., 2002; Sadai et al., 2004). Роль Chp1 была далее подтверждена идентификацией эффекторного комплекса RITS (RNA-induced transcriptional silencing), который содержит Chp1, Ago1, Tas3 и siRNAs, гомологичные центромерным внешним повторам (Motamedi et al., 2004). Кроме RITS был идентифицирован комплекс, содержащий Rdpl (RDRC — RNA-directed RNA polymerase complex), который содержит предсказанную РНК-геликазу (Hrrl) и предполагаемую поли (А) полимеразу (Cidl2). Эти компоненты, по-видимому, также являются важной составной частью процесса RNAi и сборки интактного «молчащего» хроматина на внешних повторах в центромерах (рис. 6.6) (Motamedi et al., 2004).
Наличие независимого от RNAi (и зависимого от Atfl/Pcrl) механизма сайленсинга, действующего в «молчащем» локусе типа спаривания для поддержки гетерохроматина, было обнаружено путем обработки клеток без RNAi ингибитором HDAC трихостатином А (TSA). Результатом этого явилась полная утрата «молчащего» хроматина из района mat2-mat3, имитирующая эффект делетирования atfl или pcrl у мутантов по RNAi (Hall et al., 2002; Jia et al., 2004). Однако, как отмечалось выше, для формирования «молчащего» хроматина в центромерных внешних повторах Atfl и Perl не требуются (Kim et al., 2004). Кратковременное воздействие TSA также вызывает утрату сайленсинга в центромерах, приводя к гиперацетилированию гистонов, сопряженных с дефектной функцией центромеры (Ekwall et al., 1997). Хотя это индуцированное TSA «эписостояние» является метастабильным, оно может воспроизводиться в нескольких циклах клеточного деления и даже в мейозе Наиболее вероятное объяснение заключается в том, что гетерохроматин трудно установить заново, коль скоро достигается это аномальное гиперацетили-рованное состояние. Эписостояния могут также устанавливаться в нарушенном (compromised) локусе mat2-mat3, и они тоже воспроизводятся в мейозе (Nakayama et al., 2000).
1.6. Транскрипция центромерных повторов РНК-полимеразой II связывает RNAi с модификациями хроматина
В предыдущем разделе было показано, что RNAi и модификации гистонов необходимы для сборки центромерного гетерохроматина, который может распространяться на соседние вставленные репортерные гены. Эти наблюдения поднимают такие очевидные вопросы, как вопрос о том, каким образом RNAi связана с ковалентной модификацией гистонов в формировании «молчащего» хроматина, и вопрос о том, как конкретные районы генома становятся мишенью для такой направляемой RNAi модификации хроматина и сайленсинга.
У многих организмов экспрессия специфических dsRNA, гомологичных рассматриваемому гену, приводит либо к транскрипционному (модификация ДНК/хроматина) сайленсингу гена (TGS), либо к посттранскрипционному (деградация иРНК) сайленсингу гена (PTGS). Может ли любая dsRNA у дробянковых дрожжей процессироваться так, что образует siRNAs, и индуцируют ли такие siRNAs только посттранскрипци-онный сайленсинг (РНК-нокдаун) или же они могут осуществлять также и модификации хроматина (например, H3K9me2), которые сайленсируют транскрипцию с гомологичного гена? Экспрессия dsRNAs, гомологичных репортеру GFR, продуцирует siRNAs, которые вызывают редукцию транскриптов GFP, но транскрипционная активность репортерного гена GFP не снижается
Таким образом, хотя GFP-siRNAs понижают уровни иРНК GFP, они не способны осуществлять модификации хроматина, которые приводят к транскрипционному сайленсингу. Эти GFP-siRNAs должны, следовательно, действовать лишь посттранскрипционно, разрушая иРНК GFP (Sigova et al., 2004). Неясно, почему GFP-siRNAs не индуцируют модификацию хроматина на гомологичном гене, но это может быть связано с природой синтезирующегося транскрипта или с силой промотора RNA pol II, приводящей в действие экспрессию GFP.