Охота за мутантами, дефектными по MSUD, привела к идентификации эффективного [telling] члена машинерии MSUD. Ген Sad-1 (Supressor of ascus dominance — супрессор доминантности асков), идентифицированный путем отбора мутантов, способных проходить через скрещивание, в котором asm-1 не спарен, кодирует RdRP (Shiu et al., 2001). Это позволяло предполагать, что MSUD родствен «подавлению» (quelling) у Neurospora и, в целом, RNAi. Интересно, что геном Neurospora содержит гены, которые, согласно предсказанию, кодируют три предполагаемых RdRP (одна, необходимая для «подавления», одна — для MSUD и одна с неизвестной функцией), два белка, подобных Argonaute (один для «подавления» и один для MSUD) и два белка, подобных Dicer. Было бы замечательно, если бы удалось выяснить детальный механизм MSUD
Рис. 6.14. Мейотический сайленсинг. вызываемый неспаренной MHK(MSUD)
Изображение тестов, проведенных в лабораториях Метценберга и Арамайо (Aramayo and Metzenberg, 1996; Shiuetal., 2001; Prattet al., 2004), описавших это явление Показаны только две из семи хромосомы Neurospora; их нуклеотидные последовательности изображены, соответственно, зеленым и синим цветом Прямоугольником показан ген, нормально функционирующий в мейозе. Вертикальными линиями показаны мутации, а метилирование ДНК показано красным цветом. Делеции изображены в виде пустых промежутков. Пояснения см. в тексте
2.6. Вероятные функции и практическое использование RIP, «подавления» и MSUD
RIP, по-видимому, «изготовлен по специальному заказу», чтобы ограничить экспрессию «эгоистичной ДНК», такой как транспозоны, которые управляют производством собственных копий в геноме. В соответствии с этой возможностью, огромное большинство реликтов RIP обладает очевидным сходством с транспозонами, известными у других организмов, а большинство штаммов Neurospora не имеют активныхтранспозонов (Galagan et al., 2003; Selker et al., 2003). Тем не менее, поскольку RIP ограничен премейотическими двухъядерными клетками, этот процесс не должен ни предотвращать распространение нового (например, «горизонтально» приобретенного) транспозона в вегетативных клетках, ни препятствовать дупликации однокопийного транспозона в мейотических клетках.
Рис. 6.15. Neurospora crassa
Флуорограмма розетки созревающих асков от гетерозиготного скрещивания трансформанта, сконструированного таким образом, что он экспрессирует гистон Н1, меченный (tagged) GFP Четыре аскоспоры в каждом аске обнаруживают светящиеся ядра (Freitag et al., 2004b) (фото любезно предоставлено N.B. Raju, Stanford University)
Однако с такими возможными ситуациями должны справляться механизмы «подавления» и MSUD. Хотя «подавление» не полностью супрессирует распространение транспозонов в вегетативных клетках, о чем свидетельствует пролиферация интродуцированной копии транспозона Tad, подобного LINE, оно («подавление») действительно частично сайленсирует такие транспозоны (Nolan et al., 2005). Информация о действии MSUD позволяет считать, что этот процесс будет сайленсировать любую транспозированную последовательность в мейотических клетках, даже если она присутствует лишь в виде единственной копии в геноме (Shiu et al., 2001). Кроме борьбы с блуждающими транспозонами в мейозе MSUD, по-видимому, играет также важную роль в процессе видообразования, как показывает наблюдение, согласно которому мутанты, дефектные по MSUD, ослабляют стерильность штаммов, несуших большие дупликации хромосомных сегментов, и создают возможность скрещивания близкородственных видов с N. crassa (Shiu et al., 2001).
Хотя RIP, «подавление» и MSUD могут быть помехой в некоторых генетических экспериментах, все эти явления были использованы для исследовательских целей. RIP дал первый простой способ нокаута генов у Neurospora и все еще остается предпочтительным методом получения мутантов с частичной функцией. «Подавление» тоже было использовано для уменьшения, если не полного устранения, функции гена — во многом так же, как была использована RNAi у целого ряда организмов. A MSUD дает простой способ протестировать, требуются ли те или иные конкретные гены для функционирования в мейозе (или сразу после него); если оказывается, что ген, будучи дуплицирован или находясь в эктопическом положении, вызывает стерильность, и эта стерильность устраняется мутацией, блокирующей MSUD, можно с уверенностью принять, что он играет важную роль в мейозе.