Действительный прорыв произошел после микро-секвенирования этого очищенного белка и клонирования гена. Эта HAT, выделенная из Tetrahymena, оказалась гомологичной хорошо охарактеризованному регулятору транскрипции пекарских дрожжей — белку Gcn5. До этого открытия думали, что активаторы транскрипции в основном действуют, рекрутируя РНК-полимеразу к промоторам, но эта работа показала, что активаторы транскрипции могут также обладать ферментативной активностью, модифицируя хроматин или другие регуляторы транскрипции и меняя таким образом состояние матрицы. Дверь была открыта, и вскоре после этого было показано, что многие известные регуляторы действуют как HATs.
Ядерный диморфизм инфузорий еще раз доказал свои преимущества в выяснении роли метилирования гистонов. Эта модификация у растущих клеток Tetrahymena ограничена макронуклеусами (рис. 7.4). Активность метилтрансферазы лизина гистонов (HKMT), очищенная из этих ядер, специфически модифицировала гистон 3 по лизину 4 (H3K4те), установив тем самым одну из первых корреляций между этой специфической модификацией и транскрипционной активностью (Strahl et al., 1999).
Метилирование гистона H3 по лизину 9 у вегетативно размножающихся клеток отсутствует, но специфически происходит во время развития макронуклеусов на ограниченных зародышевой линией последовательностях, которые элиминируются из соматического генома (Tav-ema et al., 2002). Регулируемое развитием установление H3K9me2 (диметилирование) на этих специфических последовательностях дает нам полезную модель для выяснения нацеливания этой модификации на эквивалент гетерохроматина (в деталях описывается ниже)
Очистка меченных Р32 гистонов из микро- и макронуклеусов показала, что H3, Н2А и линкерные гистоны сильно фосфорилированы (Allis and Gorovsky, 1981). Фосфорилированы множественные сайты макронуклеарного Н1, и эта модификация, как было показано, участвует в регулировании транскрипции специфических генов (Mizzen et al., 1999). С помощью мутационного анализа Доу и Горовски [Dou and Gorovsky] обнаружили, что эту потребность в фосфорилировании можно было имитировать добавлением в Н1 заряженых аминокислот (Dou et al., 1999). Однако эти заряженные остатки не обязательно должны находиться в соответствующих позициях фосфорилированной аминокислоты; для комплементарного эффекта требуется наличие кластера заряженных сайтов (Dou and Gorovsky, 2000,2002). Эти исследования показали, что само по себе фосфорилирование не требовалось, но что соответствующая транскрипция стимулировалась критической плотностью зарядов.
В гистоне H3 фосфорилирована единственная позиция. серии 10 (H3S10ph) (Wei et al., 1998). Эта модификация зависит от клеточного цикла и коррелирует с митозом у многих эукариот. У Tetrahymena в ходе митоза и мейоза она ограничена микронуклеусами. Замещение нормального гена гистона H3 мутантной формой, содержащей замену серина 10 аланином (S10A), вызывает дефекты в делении микронуклеуса, результатом чего оказывается отставание хромосом и анэуплоидия (Wei et al., 1999). Однако амитотическое деление макронуклеуса не затрагивается. Эти результаты демонстрируют, что фосфорилирование H3 играет важную роль в конденсации и (или) сегрегации хромосом. Уникальный ядерный диморфизм инфузорий опять позволил получить ключевые данные о роли модификаций хроматина.
6. В ходе развития макронуклеуса происходят общегеномные перестройки
Секвенирование соматических (макронуклеарных) геномов P. tetraurelia и Т. thermophila обнаружило очень большое число генов (-40 000 и -27 000, соответственно) несмотря на относительно небольшие размеры геномов (-72 Мб и -104 Мб, соответственно). Эта организация согласуется с геномом, оптимизированным для эффективной экспрессии генов (сравнение с другими эукариотными организмами см. на рис. 3.15). Это «упрощение» («streamlining») соматического генома достигается за счет массивных перестроек ДНК хромосом, происходящих из зародышевой линии, которые имеют место на специфических стадиях макронуклеарного развития (обзоры см.: Prescott, 1994: Coyne et al., 1996; Klobutcher and Herrick, 1997; Jahn and Klobutcher, 2002). Таким образом, ядерная дифференцировка генома зародышевой линии и генома соматического включает физическую реорганизацию хромосом в дополнение к установлению только что описанных различных состояний хроматина.