У большинства эукариот гистон H3, метилированный по лизину 9 (H3K9me), в значительной степени ассоциирован с репрессированной ДНК, вычленяемой в ядре как гетерохроматин (см. раздел 7 главы 3). У Tetrahymena эта модификация не обнаруживается в транскрипционно «молчащем» микронуклеусе, как можно было бы предположить, но обнаруживается исключительно в развивающихся макронуклеусах непосредственно перед перестройками ДНК или одновременно с ними (Taverna et al., 2002). Эксперименты по иммунопреципитации хроматина показали, что этой модификацией обогащены гистоны, связанные с IESs. Элиминация ДНК и формирование гетерохроматина были первоначально сцеплены друг с другом в результате идентификации хромодоменсодержащего белка (Pddl — Programmed DNA Degradation 1 protein) — обильно представленного, экспрессируемого в ходе развития белка, колокализующегося в фокусах, содержащих ДНК, ограниченную зародышевой линией и подлежащую элиминации (т.е. IESs) из соматического генома (Madireddi et al., 1994, 1996). Хромодомены — это белковые мотивы, обладающие сродством, способностью связываться с некоторыми остатками метилированных гистонов. Возможно, что архетипическая модель участия хромодоменного белка в регуляции хроматина — это связывание гетерохроматинового белка 1 (НР1 — содержащий хромодомен) с метилированным H3K9 у Drosophila, играющее роль в формировании гетерохроматиновых доменов (детали см в главе 5). Хромодомены Pddl и Pdd3, два белка, требующихся для перестроек ДНК (Coyne et al., 1999; Nikiforov et al., 2002), связываются с пептидами
H3K9me2 (Taverna et al., 2002). Для того чтобы продемонстрировать, что эта модификация хроматина требуется для перестройки ДНК, Лиу, Мочицуки и Горовски [Liu, Mochizuki and Gorovsky] использовали методику гомологичного замещения гена, чтобы заменить гены основного гистона H3 копиями, содержащими мутацию, поменявшую лизин 9 (K9Q) (Liu et al., 2004). Эти клетки не могли эффективно удалять IESs в ходе развития несмотря на тот факт, что Pddl локализовалась соответственно в предшественниках макронуклеусов, показывая тем самым, что H3K9me2 требуется для элиминации ДНК. Из-за того, что установление состояний хроматина является ключевым детерминантом эпигенетической регуляции, важный вопрос заключается в следующем: каким образом метка H3K9me2 специфически нацеливается на сегменты ДНК, обреченные на элиминацию? Как описывается ниже, несколько экспериментов продемонстрировали, что в направлении перестроек ДНК участвуют гомологичные РНК.
8. Зависящий от гомологии сайленсинг генов у инфузорий
Зависящие от гомологии, опосредуемые РНК механизмы сайленсинга широко используются эукариотами для эпигенетической регуляции. Данные о том, что такие механизмы активны у инфузорий, впервые были получены на Paramecium после трансформации вегетативного макронуклеуса неэкспрессибельными трансгенами, которые производят фенокопию менделевских мутантов в эндогенных генах. Сходные эффекты были затем воспроизведены у Paramecium и спиротрих при скармливании клеткам двунитевых РНК, что позволяло предполагать участие механизмов RNAi. Один из этих механизмов ведет к крайней форме сайленсинга генов — элиминации ДНК.
8.1. Сайленсинг, индуцируемый трансгенами
Макронуклеус Paramecium легко трансформировать с помощью микроинъекций, потому что любой введенный в него фрагмент ДНК может поддерживаться в широком диапазоне числа копий, реплицируясь автономно без потребности в каком-либо специфическом ориджине. Трансформация высококопийными, неэкспрессибельными трансгенами может переключить посттранскрипционный сайленсинг эндогенных генов, обладающих достаточным сходством по последовательности (Ruiz et al., 1998; Galvani and Sperling, 2001). Сайленсинг не наблюдается, если в трансгене присутствует 3’UTR гена (Galvani and Sperling, 2001), что заставляет предполагать, что регуляторные сигналы, присутствующие в РНК, влияют на способность конструкта индуцировать сайленсинг. Впоследствии оказалось, что сайленсинг коррелирует с накоплением гомологичных коротких РНК длиной приблизительно 23 нуклеотида (н) (Gamier et al., 2004); это указывает на связь с путем RNAi. Эти короткие РНК длиной -23 н, по-видимому, ответственны за прицельную деградацию гомологичных mRNAs и могут быть поэтому названы siRNAs (short interfering RNAs — короткие интерферирующие РНК). Сходный класс РНК длиной 23—24 н был также идентифицирован в вегетативных клетках Tetrahymena, и хотя какие-либо данные об их возможной роли отсутствуют, вполне вероятно, что они представляют собой эндогенные siRNAs (Lee and Collins, 2006).