8.2. Сайленсинг индуцируется двунитевой РНК
Двунитевая РНК (dsRNA) является вероятным первичным триггером для индуцируемого трансгеном сайленсинга, наблюдаемого у Paramecium. Сайленсирующая эффективность трансгенов коррелирует с образованием аберрантных молекул РНК, соответствующих как смысловой, так и антисмысловой нитям инъецированной последовательности. Более того, способность dsRNA стимулировать сайленсинг гена была продемонстрирована путем скармливания клеткам Paramecium бактерий Escherichia coli, экспрессирующих dsRNA клонированного гена, с использованием методологии, разработанной для Caenorhabditis elegans (Timmons and Fire, 1998; Timmons et al., 2001). Сайленсинг эндогенного гена можно наблюдать фенотипически спустя всего три вегетативных деления, т.е. меньше чем через 24 часа (Galvani and Sperling, 2002). Скармливание убитых нагреванием E.coli цнфузориям-спиротрихам, в норме питающимся водорослями, также индуцирует генный сайленсинг (Pashka et al., 2003), заставляя предполагать, что многие разные инфузории обладают этим механизмом. У Paramecium молекулярный анализ показал, что кормление dsRNA приводит к накоплению таких же -23-нуклеотидных siRNAs, какие наблюдаются после сайленсинга, индуцируемого трансгеном (Nowacki et al., 2005); это указывает, что оба эти явления базируются на общем RNAi-пути.
Сайленсинг, индуцируемый у Paramecium скармливанием dsRNA, может быть немедленно ревертирован замещением E.coli в культуральной среде нормальными пищевыми бактериями; аналогичным образом прямая микроинъекция dsRNA в цитоплазму индуцирует лишь временный, преходящий сайленсинг гомологичных генов, предположительно потому, что инъецированная dsRNA быстро разбавляется в ходе вегетативного роста (Galvani and Sperling, 2002). Эти наблюдения позволяют предположить, что молекулы dsRNA не могут быть амплифицированы до сколько-нибудь значительного уровня в цитоплазме вегетативных клеток, в отличие от судьбы dsRNA в С.elegans, где это может приводить к наследуемому сайленсированному состоянию. Это, далее, предполагает, что RNAi у Paramecium не приводит к установлению стабильного транскрипционного сайленсинга гена в макронуклеусе. Наследуемый сайленсинг, вероятно, требовал бы метилирования гистона H3K9. А, как упоминалось выше, эта модификация, очевидно, отсутствует в вегетативном макронуклеусе, по крайней мере у Т. thermophila.
9. Перестройки генома направляются зависящими от гомологии механизмами
Во время развития инфузории три разных генома должны различаться и канализироваться по трем раздельным направлениям: микронуклеарный геном зародышевой линии должен сохраняться интактным, в то время как развивающийся соматический геном в новом макронуклеусе направляется таким образом, чтобы подвергнуться экстенсивной реорганизации; материнский же соматический геном обречен на разрушение. В этих более широких рамках цель исследователей, работающих на инфузориях, заключалась в том, чтобы понять воспроизводимость паттернов ДНК-перестроек. Первоначальные усилия были направлены на то, чтобы идентифицировать ds-активные мотивы ДНК-последовательностей, которые могли бы рекрутировать рекомбинационные белки, но поиски дали мало четких результатов (см.: Yao et al., 2002; Betermier, 2004). Первичная ДНК-последовательность определенно не является единственным детерминантом, направляющим реорганизацию макронуклеарного генома, — вывод, подкрепляемый данными о том, что H3K9-метилирование маркирует сегменты ДНК для элиминации. Более того, многие паттерны перестроек, как описано ниже, чувствительны к зависящим от гомологии эффектам, что делает возможным наследование альтернативных паттернов по материнской линии в последующих половых поколениях, независимо от Менделевской передачи генома дикого типа зародышевой линии Наследование паттернов перестройки удовлетворяет, следовательно, определению эпигенетического явления.
9.1. Экспериментальная индукция специфических делеций в развивающемся макронуклеусе
Еще до того как посттранскрипционный сайленсинг генов был описан у Paramecium, было обнаружено, что введение клонированных последовательностей в большом числе копий в вегетативный макронуклеус изменяет ДНК-перестройки в половом потомстве трансформированных клонов. Удивительно, что последовательности, гомологичные трансгену, специфическим образом делегировались по неточному механизму, в то время как микронулеарный геном оставался интактным (рис. 7.6) (Meyer, 1992). Это явление, по-видимому, было весьма общим, поскольку все испытанные фрагменты ДНК могли производить делеции (Meyer et al., 1997). Эти эксперименты показывали, что в ходе половых событий сиквенс-специфичная информация передается через цитоплазму из трансформированного материнского макронуклеуса в развивающийся зиготический макронуклеус. Эта всеобщность данного эффекта говорила не в пользу тех трактовок, в которых роль отводилась сиквенс-специфичным ДНК-связывающим белкам, продуцируемым или титруемым инъецированными трансгенами. Наиболее экономное объяснение, согласующееся с наблюдаемой специфичностью, предполагает, что нуклеиновые кислоты, предположительно молекулы РНК, переносятся между ядрами и распознают свои мишени на основе взаимодействий, базирующихся на спаривании.