Рис. 7.6. Индуцированные трансгеном делеции у Paramecium
(а) У дикого типа ген А (красные стрелки) расположен вблизи гетерогенных концов макронуклеарной хромосомы; розовые прямоугольники = макронуклеарные теломеры. Паттерн перестроек макронуклеарной хромосомы надежно репродуцируется в ряду поколений, (б) Введение большого числа копий трансгенов А в материнский макронуклеус может индуцировать полную делецию эндогенного гена А в половом потомстве, когда новый макронуклеус развивается из производного зародышевой линии дикого типа. Новые макронуклеарные теломеры располагаются непосредственно «вверх по течению» от гена А
Конструкты, которые эффективно индуцируют постзиготические делеции, являются неэкспрессибельными трансгенами, такими как трансгены, содержащие мутации типа сдвига рамки считывания или усечения 5’ или 3’ UTRs (Gamier et al., 2004). Те из них, которые могут продуцировать стабильные, способные транслироваться иРНК, не стимулируют элиминацию гомологичных генов из развивающихся макронуклеусов. Те же конструкты, которые стимулируют делецию ДНК, вызывают также сайленсинг эндогенных материнских генов в ходе вегетативного роста трансформированных клонов. Таким образом, постзиготические делеции коррелируют с презиготическим сайленсингом и с накоплением ~ 2 3 - нукл еотид н ых siRNAs. Эти siRNAs, как было показано далее, сохраняются в клетках на протяжении всего развития, что заставляет предполагать, что они могут отвечать за включение этих делеций.
Если ассоциированные с сайленсингом siRNAs направляют ДНК-перестройки, тогда введение dsRNA до начала или во время развития должно стимулировать элиминацию гомологичной последовательности в потомстве. Чтобы это проверить, клеткам Paramecium, которым скармливались E.coli штамма, продуцирующего dsRNA, гомологичную кодирующей последовательности ND7 — гену, участвующему в регулируемом экзоцитозе секреторных пузырьков, называемых трихоцистами, — дали возможность пройти автогамию и развить новые макронуклеусы из микронуклеусов дикого типа. Некоторое число поставтогамных потомков продемонстрировали мутантный фенотип ND7благодаря элиминации этого гена из их макронуклеусов (Gamier et al., 2004). Даже потомство фенотипически дикого типа показало частичную элиминацию копий гена ND7. Как и~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с трансген-индуцированным сайленсингом, ~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с кормлением dsRNA, сохранялись, как было показано, в этих клетках на протяжении всей аутогамии (Nowacki et al., 2005), подтверждая их участие в «нацеливании» постзиготических делеций. Явление индуцированной ДНК делеции, направляемой dsRNA, не ограничивается Paramecium. Микроинъекция конъюгирующим Tetrahymena смысловой и антисмысловой РНК, транскрибированной in vitro и гомологичной геномным локусам, в норме сохраняющимся в макронуклеусе, приводит к неточной делеции этих последовательностей (Yao et al., 2003).
10. Паттерны перестроек определяются, вероятно, путем сравнения геномов зародышевой линии и соматического
10.1. Парадигма d48: эпигенетическое наследование альтернативных перестроек
Хотя перестройки, индуцируемые трансгенами и dsRNA, иллюстрируют эпигенетическую природу процесса элиминации ДНК, возможно еще более удивительными являются наблюдения, что паттерны индуцированных перестроек могут наследоваться в последовательных раундах макронуклеарного развития. Первое доказательство эпигенетической регуляции перестроек было обнаружено, когда аберрантная делеция из макронуклеуса гена, кодирующего у P.tetraurelia поверхностный антиген А, оказалась цитоплазматически наследующейся в скрещиваниях с диким типом (рис. 7.7) (Epstein and Fomey, 1984). В макронуклеусах дикого типа ген А локализован вблизи конца хромосомы на расстоянии 8,13 либо 26 тн от теломеры, что диктуется тремя альтернативными сайтами фрагментации. Было обнаружено, что вариантная клеточная линия, называемая d48, не экспрессирует ген А, потому что сам этот ген был утерян вместе со всеми последовательностями «вниз по течению», когда формировалась его теломера на 5’-конце этого гена (Fomey and Blackburn, 1988). Эксперименты по трансплантации ядер подтвердили, что микронуклеус зародышевой линии d48 несёт ген А дикого типа. Например, замена микронуклеуса d48 микронуклеусом штамма дикого типа не предотвращает материнской передачи делеции гена А половому потомству; и наоборот, микронуклеус d48, будучи трансплантирован в клетку дикого типа, давал начало после автогамии новому макронуклеусу, который содержал ген A (Harumoto, 1986; Kobayashi and Koizumi, 1990). Сходные эксперименты, сфокусированные на поддержании или делеции еще одного проксимального по отношению к теломере гена поверхностного антигена, гена В, показали, что такие материнские эффекты могут наблюдаться и в других районах генома (Scott et al., 1994). В совокупности эти исследования заставляют предполагать, что некий геномный район должен присутствовать в материнском макронуклеусе для того, чтобы эффективно сохраняться и амплифицироваться в развивающемся макронуклеусе до числа копий, характерного для дикого типа.