11. Trans-нуклеарное сравнение целых геномов, опосредованное РНК-интерференцией
Зависящие от гомологии эффекты, описанные выше, демонстрируют существование «переговоров» [a cross talk] между материнским соматическим геномом и геномом зародышевой линии в процессе ядерной дифференцировки, которые могут существенным образом менять паттерны перестройки ДНК. Тот факт, что затрагиваются только высоко гомологичные последовательности, является сильным аргументом в пользу предположения, что эти «переговоры» опосредуются нуклеиновыми кислотами. В этом регуляторном механизме могли бы, возможно, участвовать транскрипты из материнского макронуклеуса, экспортируемые в развивающийся макронуклеус, где, в случае, если они содержат IES, они предотвращали бы элиминацию гомологичных последовательностей. Однако было показано, что эти предполагаемые материнские транскрипты не участвуют в качестве донорских матриц в ходе репарации двунитевых разрывов, индуцируемых конститутивной эксцизией IES (Duharcourt et al., 1995). Если материнские защитные транскрипты существуют, эти ~23-нуклеотидные siRNAs, которые диктуют сайленсинг генов, могут косвенным образом «нацеливать» делецию ДНК, стимулируя разрушение тех из них, которые идентичны по последовательности. Сама по себе эта роль siRNAs не может объяснить материнское наследование перестроечных паттернов в последовательных поколениях. Как это обсуждается ниже, возможно, что в конечном счете реорганизацией генома управляет взаимодействие между материнскими макронуклеарными транскриптами и новым классом коротких РНК, происходящих из мейотического микронуклеуса.
11.1. Связь коротких РНК с элиминацией ДНК
У Tetrahymena каноническая модификация гетерохроматина, H3K9-метилирование, маркирует хроматин, связанный с IESs, непосредственно перед их вырезанием. Каким образом эта модификация осуществляет специфическое «нацеливание» на эти сегменты ДНК, предназначенные для элиминации? Был описан RNAi-подобный путь, который использует RNA-гиды, чтобы направить ее на соответствующие локусы (обзор см. Mochizuki and GorovskY, 2004; Yao and Chao, 2005). Первоначальным указанием на то, что делеция ДНК использует молекулы гомологичных РНК, явилось наблюдение, что у Tetrahymena IESs двунаправлено транскрибируются на ранних этапах конъюгации (Chalker and Yao, 2001). Реальный прорыв случился, когда Mochizuki и др. (2002) идентифицировали белок семейства PIWI/Argonaute, кодируемый геном TWI1, который экспрессируется в ходе развития и необходим для перестройки ДНК (Mochizuki et al., 2002) Поскольку белки Argonaute являются ключевыми игроками в процессах, включаемых RNAi, эти исследователи искали и нашли такой класс эндогенных малых (-28 нуклеотидов) РНК, которые предпочтительно комплементарны к последовательностям, ограниченным зародышевой линией. Деструкция гена TWI1 дестабилизировала эти короткие РНК и ликвидировала метилирование H3K9 в развивющемся соматическом ядре. Эта работа, опубликованная в 2002 году, в совокупности с экспериментами на Schizosaccharomyces pombe (главы 6 и 8) утвердила новую парадигму, согласно которой
гетерохроматин генерируется действием гомологичных РНК, «нацеливающих» метку сайленсинга (H3K9) на специфичные локусы.
Характеристика гена DCLl, кодирующего рибонуклеазу Dicer, осуществляющую процессинг двусторонних транскриптов в ~28-нуклеотидные малые РНК, обеспечила еще более глубокое проникновение в общую регуляцию этого процесса (Malone et al., 2005; Mochizuki and Gorovsky, 2005). Этот белок экспрессируется на высоком уровне на ранних этапах конъюгации и локализуется в премейотических микронуклеусах, что указывает на то, что генерация малых РНК компартментализована во времени и пространстве в пределах этого ядра зародышевого пути. Разрушение гена DCL1 вызывало утрату способности производить малые РНК, аккумуляцию транскриптов зародышевой линии и, в конечном счете, неспособность к вырезанию IES. Интригующим моментом является то, что утрата малых РНК не ликвидирует метилирование H3K9, как это наблюдалось в линиях с нокаутом по TWI1. Тем не менее, анализ с помощью иммунопреципитации хроматина показал, что эта модификация больше не является обогащенной на IESs; таким образом, малые РНК необходимы для того, чтобы «нацеливать» эту модификацию хроматина на нужные локусы (Malone et al., 2005).