Ядерный геном дробянковых дрожжей состоит из трех хромосом величиной от 3,5 до 5,7 млн. о. Каждая хромосома содержит, особенно в центромерах, большие блоки повторяющейся ДНК упакованные в гетерохроматин. Кроме того, локусы типа спаривания (контролирующие тип клетки) и субтеломерные участки ДНК также содержат повторяющиеся последовательности, упакованные в гетерохроматин. Мы знаем теперь, что сборка ДНК в гетерохроматин играет и регуляторную, и структурную роль. В случае локусов типа спаривания у дрожжей регуляция генной транскрипции гетерохроматином важна для идентичности клеточного типа. В случае теломер и центромер гетерохроматин играет структурную роль, которая важна для правильного расхождения хромосом в ходе клеточного деления. Более того, повторяющиеся последовательности ДНК и перемещающиеся элементы составляют большую долю (в некоторых случаях более половины) генома многих эукариотных клеток. Гетерохроматин и связанные с ним механизмы играют ключевую роль в поддержании стабильности генома, регулируя активность повторяющихся последовательностей. Недавние исследования вскрыли удивительную потребность в компонентах RNAi-пути для процесса образования гетерохроматина у дробянковых дрожжей и позволили выяснить, каким образом эти два пути могут работать совместно на уровне хроматина. Говоря коротко, молекулы малых интерферирующих РНК (siRNA), являющиеся сигнатурами RNAi и других механизмов сайленсинга на основе dsRNA, собираются в комплекс индуцируемого РНК транскрипционного сайленсинга (RITS — RNA-Induced Transcriptional Silencing) и «направляют» эпигенетические модификации хроматина и формирование гетерохроматина в комплементарных участках хромосом. RITS использует зависимое от siRNA спаривание оснований для того, чтобы направлять ассоциацию либо с ДНК, либо с последовательностью вновь синтезируемой РНК в локусе-мишени, который должен быть сайленсирован, — ассоциацию, которая стабилизируется непосредственным связыванием с метилированным гистоном H3. Присутствие этих двух активностей в RITS включает формирование гетерохроматина совместно с хорошо известными, ассоциированными с гетерохроматином факторами и непосредственно связывает РНК-сайленсинг с модификацией гетерохроматина.
У A. thaliana и других эукариот (за исключением Saccharomyces cerevisiae) участки центромерной ДНК также состоят из повторяющихся элементов. Эти и другие повторяющиеся последовательности, такие как ретроэлементы и другие транспозоны, являются источниками siRNAs, привлекая метилирование H3K9 и ДНК. Здесь, опять-таки, несколько компонентов пути RNAi необходимы для инициации и поддержания этих событий репрессивного метилирования. В этой главе мы обсуждаем, как образуются гетерохроматиновые siRNAs и как они опосредуют модификации ДНК и (или) хроматина у дробянковых дрожжей и A. thaliana.
1. Обзор RNAi-пути
Хотя термин «RNAi» первоначально использовался для описания сайленсинга, который опосредуется экзогенной dsRNA у С. elegans (Fire et al., 1998), сейчас он в широком плане обозначает сайленсинг генов, включаемый dsRNA того или иного рода. Этапы RNAi включают образование dsRNA (которая может быть эндогенной или экзогенной, как, например, вирусная РНК), её процессинг в siRNA и «нацеливание» этих молекул либо на hRNAs (PTGS), либо на участки хроматина (TGS), чтобы вызвать сайленсинг. Поэтому, прежде чем представить компоненты механизма RNAi, специфичные для TGS, мы обсудим источник dsRNA, запускающих механизм RNAi.
dsRNA могут образовываться в результате двунаправленной транскрипции повторяющихся элементов ДНК или транскрипции молекул РНК, спсобных к спариванию оснований внутри себя с образованием сегментов dsRNA (рис. 8.1, а и б, соответственно) Например, транскрипция с участков инвертированных повторов дает молекулы РНК, складывающиеся сами на себя с образованием шпилечных структур. Затем dsRNA расщепляются ферментом Dicer — рибонуклеазой класса RNase III, которая генерирует siRNAs. siRNAs — это комплементарные дуплексы величиной 21—27 нуклеотидов, обладающие характерным «свисающим концом» [overhang] длиной 2 нуклеотида на каждом 3’-конце дуплекса (Hamilton and Baulcombe, 1999; Zamore et al., 2000; Bernstein et al., 2001; Elbashir et al., 2001: Hannon. 2002; Zamore, 2002; Bartel, 2004; Baulcombe, 2004). Эти дуплексы раскручиваются в однонитевые siRNAs, которые действуют как «проводники», взаимодействуя на основе спаривания оснований с комплементарными последовательностями-мишенями. Они являются, следовательно, факторами специфичности и играют центральную роль во всех механизмах сайленсинга, опосредованных RNAi.