Крайне важным вопросом при разработке роли RNAi в сборке гетерохроматина является вопрос о том, связывается ли RITS/RDRC с ДНК или же с вновь образующейся РНК. Наблюдение, что компоненты механизма
а Очевидный ортолог хромодоменного белка, Chp1, не был идентифицирован у других модельных организмов, перечисленных здесь, но большинство эукариотических клеток содержит множественные хромодоменные белки. СЬЕЗ у Arabidopsis является хромодоменной ДНК-метилтрансферазой, которая работает в том же пути, что и AG04, и может быть аналогичной Chp1.
6 Никакие очевидные ортологи Tas3 не были идентифицированы, но имеет место слабое сходство по аминокислотной последовательности с белком, специфичным для яичника и семенника мыши (NP 035152).
в Cid 12 относится к большому семейству консервативных белков, имеющих сходство по аминокислотной последовательности с классической поли(А)полимеразой, а также с 2’-5’-олигоаденилатными энзимами.
г С. elegans обладает примерно 20 доменными белками SET, но H3K9 HKMT не была еще идентифицирована у этого организма. д S. pombe содержит другой Rikl-подобный белок, Ddbl, который участвует в репарации повреждений ДНК, но неизвестно, участвует ли он и в формировании гетерохроматина.
RNAi, связывающиеся с транскриптом гена, могут индуцировать зависимый от хроматина сайленсинг генов в cis-положении, ясно демонстрирует, что этот процесс может стимулироваться посредством первоначальных взаимодействий с вновь синтезируемыми РНК-транскриптами (Buhler et al., 2006). Важно, что m-ограничение исключает возможность того, что начальные события синтеза dsRNA и образование siRNA происходят на зрелых транскриптах, где hRNA, полученные с разных аллелей, нельзя различить. Более того, модель РНК-РНК-взаимодействия прямо предсказывает, что для сборки гетерохроматина, опосредованной RNAi, должна быть необходимой транскрипция в локусе-мишени. Хотя эта потребность в транскрипции и не была непосредственно проверена, мутации в двух разных субъединицах РНК-полимеразы II (RNA pol II), обозначаемых Rpb2 и Rpb7, характеризуются специфическими дефектами в образовании siRNA и сборке гетерохроматина, но не в общей транскрипции (Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005). Это заставляет вспомнить мутанты Rbpl, которые характеризовались дефектами в модификациях гистонов (т.е. метилировании H3K4 и убиквитинировании Н2В), сопряженными с элонгацией при транскрипции (Hampsey and Reinberg, 2003), и создает прецедент для предположения о том, что опосредованное RNAi метилирование по H3K9 и формирование гетерохроматина могли бы быть сопряжены с транскрипционной элонгацией через ассоциацию комплексов RNAi с РНК-полимеразой II. В действительности, в противоположность широко принятому мнению о том, что гетерохроматин является недоступной структурой, подавляющей транскрипцию, опосредованная RNAi сборка гетерохроматина очень мало влияет или вовсе не влияет на ассоциацию РНК-полимеразы II с центромерными повторами у S. pombe (Volpe et al., 2002; Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005; Buhler etal., 2006). Следовательно, вновь синтезируемые РНК-транскрипты, действующие как матрицы для RITS в модели РНК-РНК-распознавания, присутствуют в гетерохроматиновых доменах (рис. 8.4).
В пользу модели РНК-РНК-«нацеливания» говорит также наблюдение, что компоненты комплексов как RITS, так и RDRC могут быть локализованы в некодирующих центромерных РНК в экспериментах по поперечным сшивкам in vivo (Motamedi et al., 2004). Эта локализация зависит от siRNA, что позволяет предположить участие в ней взаимодействий с некодирующей РНК на основе спаривания оснований. Кроме того, она требует HKMT Clr4, что позволяет предполагать, что она сопряжена со связыванием RITS с метилированными H3K9 и происходит на хроматине. Тем не менее, нельзя исключить, что siRNAs могут также распознавать ДНК непосредственно, на основе взаимодействий, базирующихся на спаривании оснований. Например, у растений siRNAs, комплементарные к промоторным районам, которые (предположительно) не транскрибируются, все еще могут направлять метилирование ДНК, которое является еще одной модификацией, происходящей в ходе формирования гетерохроматина в этих районах (глава 9).
7. Как RNAi рекрутирует энзимы, модифицирующие хроматин?
Рекрутирование Clr4 и Swi6 является ключевым этапом в инициации метилирования по H3K9 и сборки гетерохроматина в модели авторегуляторной модификации-связывания (рис. 8.3 и 8.4) (Grewal and Moazed, 2003). Однако, поскольку связь RITS с хроматином и катализируемое Clr4 метилирование гистонов по H3K9 являются взаимозависимыми процессами, оказалось трудным определить событие, обеспечивающее первоначальное переключение зависимой от RNAi сборкой гетрохроматина. Одно из решений этой проблемы «курицы и яйца» заключается в том, что первоначальный сигнал для сборки гетерохроматина мог бы быть обеспечен зависимыми от siRNA взаимодействиями на основе спаривания оснований (рис. 8.4). В соответствии с этой гипотезой генерация de novo ura4+ siRNAs стимулирует сайленсинг прежде активной копии гена ura4\ сопряженный с рекрутированием RITS и Swi6 к хроматину (Buhler et al., 2006). Исходное связывание RITS может, однако, быть преходящим и трудным для регистрации; стабильное связывание RITS с хроматином требовало бы двойных взаимодействий между (1) связанными с RITS siRNAs и вновь синтезируемым транскриптом и (2) связыванием хромодомена Chp1 с метилированными H3K9 В этой модели сам RITS непосредственно рекрутирует Clr4. Альтернативная возможность заключается в том, что Clr4 может рекрутироваться по параллельному пути с участием одного или нескольких белков, связывающихся с ДНК, как это имеет место в районе «молчащего» типа спаривания и в теломерных районах (Jia et al., 2004$ Kanoh et al., 2005). В любом сценарии опосредованное Clr4 метилирование H3K9 было бы необходимо для стабилизации связи RITS с хроматином, что затем ведет к рекрутированию RDRC, синтезу dsRNA и образованию siRNA (рис. 8.5).