Рис. 8.5. Модель котранскрипционного образования dsRNA и siRNA и рекрутирование комплекса Clr4-Rik1-Сиl4-метилтрансферазы гистонов у S. pombe
Недавно обнаружили, что Clr4 является компонентом мультипротеинового комплекса, который содержит белок Rikl гетерохроматина. Cullin E3-убиквитинлигазу и несколько других белков (Hong et al., 2005; Horn et al., 2005; Jia et al. 2005; Li et al., 2005). Далее эти ассоциированные с Clr4 белки усиливают связь между РНК и формированием гетерохроматина. Белок Rikl является членом большого семейства белков типа р propeller WD repeat, участие которых в связывании с РНК или ДНК предполагалось. Среди членов этого белкового семейства — фактор CPSF-A (Cleavage Polyadenylation Specificity Factor А), участвующий в сплайсинге пре-иРНК, и белок Ddbl (DN A damage binding 1), участвующий в связывании с поврежденной УФ ДНК. Особый интерес представляет CPSF-A, поскольку Rikl сходен по последовательности со своим предполагаемым связывающимся с РНК доменом, участвующим в распознавании последовательностей полиаденилирования иРНК (Barabino et al., 2000). Белок Ddbl, подобно белку Rikl, является компонентом комплекса Си14-Е3-убиквитинлигазы и участвует в распознавании и репарации ДНК, поврежденной УФ (Higa et al., 2003; Zhong et al., 2003). Весьма интригующая возможность заключается в том, что Rikl действует похожим на действие CPSF-A и Ddbl образом, связываясь во время сборки гетерохроматина с продуктом, произведенным RNAi (рис. 8.5).
8. Модификации хроматина и ДНК у Arabidopsis, опосредованные RNAi
Механизм, посредством которого RNAi направляет модификации гетерохроматина у растений, сходен с таковым у дробянковых дрожжей, хотя имеются и многочисленные отличия. Наиболее важное отличие заключается в том, что у растений метилированная ДНК имеется во многих репрессивных районах гетерохроматина: в этом отношении они напоминают позвоночных, но отличаются от червей и Drosophila (Lippman and Martienssen, 2004). Четыре цикла генетического скрининга, направленного на отбор мутантов с ослабленным TGS, опосредованным РНК, выявили мутантов по HKMTs, специфичным к H3K9, и по компонентам RNAi, но они также вскрыли необходимую функцию ДНК-метилтрансфераз, SWI/ SNF-комплексов ремоделинга и новую РНК-полимеразу (Baulcombe, 2004). Этот скрининг детально описан в главе 9, но здесь мы кратко сравним этот механизм у дробянковых дрожжей и у растений.
Для каждого скрининга на мутанты сайленсинга использовались инвертированные повторы, введенные в trans-конфигурации, чтобы индуцировать сайленсинг эндогенных или трансгенных репортерных генов. Ослабление сайленсинга указывает на мутацию, возникшую в некоем необходимом компоненте пути, ведущем к сайленсингу. Использованными при этом эндогенными генами были PAI2 (участвует в биосинтезе аминокислот) (Mathieu and Bender, 2004) и SUPERMAN (транскрипционный фактор, регулирующий развитие цветка) (Chan et al., 2004), и эти репортерные гены управлялись либо сильным вирусным промотором, либо сильным промотором, специфичным для семени (Matzke et al., 2004). В каждом случае промотор был мишенью для сайленсинга, в некоторых случаях вместе с остальной частью данного гена. Ряд генов, найденных в результате этих экспериментов по скринингу, проиллюстрирован на рис. 8.6 (см. также табл. 9.1). Был идентифицирован лишь один мутант по RNAi (в одном из циклов скрининга), и это был ген AG04 (аргонавт). Однако в трех циклах скрининга были обнаружены мутанты по ДНК-метилтрансферазам, в том числе МЕТ1 и СМЕТЗ. Третья ДНК-метилтрансфераза, родственная DNMT3 млекопитающих, была идентифицирована методом обратной генетики, поскольку эта активность кодируется DRM1 и DRM2, двумя избыточными генами, которые невозможно определить в ходе скрининга одиночных мутантов (глава 9). И в самом деле, избыточность может объяснить невозможность обнаружить дополнительне компоненты аппарата RNAi: например, хотя DCL3 (DICER-LIKE 3) и RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2 (RDRP) преимущественно требуются для производства siRNA размером 24 нуклеотида, ассоциированной с транспозонами и повторами, по меньшей мере два других гена DCL у Arabidopsis могут в некоторой степени замещать DCL3 (Gasciolli et al., 2005).