Среди других мутантов, обнаруженных при скрининге РА 12, были мутанты по гену KYP/SUVH4 (гену H3K9-метилтрансферазы) и содержащему хромодомен гену СМТЗ (гену ДНК-метилтрансферазы). Параллели с дробянковыми дрожжами в этом случае поражают, поскольку комплекс RITS содержит как белок Argonaute, так и хромодоменный белок Chp1, который для своей ассоциации с хромосомой зависит от метилирования H3K9. Однако, в отличие от дробянковых дрожжей, у Arabidopsis утрата СМТЗ или H3K9me2 не приводит к потере siRNA (Lippman et al., 2003), и еще неясно, формируют ли эти белки комплекс с AG04. У Arabidopsis имеются, однако, несколько других HKMTs, специфичных к H3K9; по крайней мере три из них обладают генетической функцией, так что и здесь избыточность может частично объяснять ситуацию (Ebbs et al., 2005)
Рис. 8.6. Белки RNAi и хроматина, необходимые для метилирования ДНК и гистонов, опосредованного RNAi, у Arabidopsis
Синтез dsRNA с повторяющихся элементов ДНК обеспечивает субстрат для опосредованного Dicer расщепления и производства siRNA (DCL3 и другие белки типа Dicer). Направляемые РНК РНК-полимеразы (RdRp, RdR2) и РНК-полимераза IV (RNA Pol IV) могут непосредственно участвовать в синтезе dsRNA или ее амплификации. siRNAs затем грузятся на белки Argonaute (напр., AG04), что, вероятно, в ассоциации с другими факторами помогает «нацелить» похожие повторяющиеся последовательности для метилирования ДНК и H3K9
Мутанты по другим ДНК-метил трансферазам, МЕТ1 и DRM1/2, в противоположность мутантам по СМТЗ, приводят к утрате накопления siRNA, по крайней мере, с некоей подгруппы транспозонов и с тандемных повторов, которые обычно продуцируют siRNA, если они транскрибируются (Martienssen, 2003). В этих случаях утрата siRNA скоррелирована с потерей H3K9me2 (Cao et al., 2003; Lippman et al., 2003). Мутанты по AT-Фазе DDM1 (decreased DNA methylation) SWI2/SNF2-ремоделинга хроматина также ликвидируют накопление siRNA и H3K9me2 с большой группы транспозонов, хотя в тех случаях, когда siRNA сохраняется, сохраняется и H3K9me2 (Lippman et al., 2003). Возможно поэтому, что siRNA у растений связана с хромосомой через метилированную ДНК вместо связывания (или в дополнение к связыванию) через метилированные гистоны. как это имеет место у S. pombe (рис. 8.7).
DDM1 обладает сильно выраженной специфичностью к транспозонам и повторам и должна как-то распознавать их как последовательности, отличные от генов. siRNA, возможно связанная с хромосомой с помощью метил-связывающих белков, могла бы обладать необходимой специфичностью для такого разграничения. В соответствии с этой идеей, транспозоны и повторы у Arabidopsis являются основным источником siRNA размером 24 нуклеотида и некоторых siRNA размером 21 нуклеотид (Lippman et al., 2004). Центромерные сателлитные повторы, расположенные в виде десятков тысяч тандемных копий по обе стороны каждой центромеры, также транскрибируются И процессируются RNAi (рис. 8.6). Этот процессинг зависит от DCL3, RDR2 и DDM1. Сайленсинг также зависит от H3K9me2 и СМТЗ. Однако сайленсинг здесь более сложный, чем у дробянковых дрожжей, поскольку ретротранспозонные вставки в эти повторы могут сайленсировать их, а это зависит от других механизмов с участием МЕТ1, DDM1 и деацетилазы гистонов HDA6 (May et al., 2005).
Как упоминалось выше, у дробянковых дрожжей субъединицы РНК-полимеразы II (RNA Pol II) необходимы для сайленсинга и производства siRNA, что говорит в пользу идеи, согласно которой аппарат RNAi и модификации хроматина рекрутируется к хромосомам с помощью вновь синтезируемых транскриптов (рис. 8.5). У Arabidopsis две субъединицы новой РНК-полимеразы (RNApol IV) были обнаружены в ходе одного из четырех выше упоминавшихся скринингов (Kanno et al., 2005), но сначала были изолированы как слабые мутанты по PTGS, наряду с мутантами по РНК-зависимой РНК-полимеразе (Herr et al., 2005). Пока еще не известно, какая матрица используется RNA pol IV, но предположили (Vaughn and Martienssen, 2005), что это могут быть и метилированная ДНК (Onodera et al., 2005), и двунитевая РНК. Только самые крупные субъединицы уникальны для RNA pol IV, которая, как предполагается, использует тот же набор малых субъединиц, что и RNA pol II Дополнительные SWI2/SNF2-peмoдeлepы хроматина, которые также были обнаружены в ходе этих опытов по скринингу, могут изменять локальную структуру хроматина и облегчать процессивность RNA pol IV (Kanno et al., 2004). Сходную роль можно предположить для DDM1, хотя потребность для DDM1 (которая также является ремоделером хроматина) в сайленсирующих гранспозонах гораздо более жесткая, чем у RNA pol IV или других белков SWI2/SNF2.