5. обнаружения таких процессов, как не клеточноавтономный сайленсинг и транзитивность (раздел 3.2, подраздел «Не клеточно-автономный сайленсинг и транзитивность»), которые обусловлены РНК-зависимыми РНК-полимеразами, шесть из которых закодированы в геноме Arabidopsis.
Все это обсуждается при рассмотрении трех основных путей РНК-направляемого замалчивания генов у растений (рис. 9.3а-в). Следует иметь в виду, что эти пути взаимно перекрещиваются друг с другом. Их функционально различные компоненты приведены в табл. 9.2.
3.2. Путь 1: связанное с трансгенами посттранскрипционное и индуцированное вирусами замалчивание генов (PTGS/VICS)
Направляемое PHKi замалчивание генов, индуцированное трансгенами и вирусами, изначально функционировало как защитная система хозяина от чужих и инвазивных нуклеиновых кислот в виде соответствующих вирусных компонентов, транспозонов и трансгенов.
Рис. 9.3. Пути РНК-обусловленного сайленсинга у растений
Несмотря на то, что отдельные элементы и пути сайленсинга могут перекрываться или быть общими, все же различают три основных пути сайленсинга, они отличаются по источникам двутяжевых РНК, классу маленьких РНК, природе мишеней-последовательностей и характеру сайленсинга. На рисунке эффекторные комплексы сайленсинга, содержащие белки аргонавты, показаны в виде светлосерых шариков. Желтыми прямоугольниками помечены процессы, протекающие в ядре. Детали и названия регуляторных элементов описаны в тексте и табл. 9.2. Специфические растительные белки отмечены зеленым. PTGS — посттранскрипционное замалчивание генов, VIGS — индуцированное вирусом замалчивание генов, TGS — транскрипционное замалчивание генов, RdDM — направляемое РНК метилирование ДНК, IR — инвертированные повторы, AS — антисенс, антисмысловая последовательность, vRdRP — вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза, аРНК — аберрантная РНК, siPHK — короткая интерферирующая РНК, RISC — РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (взято с изменениями из работы Meins et al., 2005)
Трансгенные конструкции можно ввести в растительный геном в смысловой или антисмысловой ориентации или в виде инвертированных повторяющихся последовательностей ДНК. Вирусы могут иметь геномы, представленные одно- или двутяжевыми ДНК или РНК. Поэтому dsPHK могут возникать разными путями. В принципе антисмысловые транскрипты могут комплементарно спариваться с информационными РНК-мишенями с образованием двутяжевых РНК. Транскрипция инвертированных повторов ДНК может приводить к образованию шпилечных РНК. Вирусные РНК, кодирующие собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу (vRdRP) и реплицирующиеся с образованием двутяжевых интермедиатов РНК, включаются в игру прямо на уровне двутяжевых РНК. Наоборот, смысловые трансгены и ДНК-содержащие вирусы как, например, джеминивирусы, для образования двутяжевых РНК нуждаются в клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразе RDR6 и других генетически идентифицированных факторах (SDE3, SGS3 и WEX; табл. 9.2). При образовании субстратов для RDR6 транскрипты или смысловые трансгены и вирусные ДНК должны быть в известном смысле аберрантными, например, без 5’ cap или полиаденилатного хвоста (Meins et al., 2005).
Активность DCL, необходимая для процессирования dsPHK с образованием siPHK при PTGS, еще не идентифицирована (DCLX). Анализ dell мутантов с частично утраченными функциями показал, что DCL1, по-видимому, не вовлечен в эту стадию процессинга. Специфический растительный белок HEN 1 метилирует 3’-нуклеотид у маленьких РНК, защищая их от уридилирования и последующей деградации (Li et al., 2005). DCL2 участвует в образовании siPHK из некоторых, но не всех, вирусных РНК (Xie et al., 2004).
PTGS и VIGS приводят к образованию двух разных по величине и функциональному значению классов siPHK, состоящих из 21-22 нуклеотидов и 24-26 нуклеотидов, соответственно (Baulcombe, 2004). В целом, считается, что 21-членные siPHKs участвуют в растеплении иРНК, а 24-26-членные, называемые гетерохроматиновыми siPHK, вызывают эпигенетические модификации в гомологичных последовательностях ДНК (TGS; см. раздел 3.4).
Вслед за осуществленным DCL процессингом дуплекс siPHK раскручивается и антисмысловая цепочка взаимодействует с одним из белков из семейства аргонавтов с образованием комплекса индуцированного РНК сайлесинга (RISC). RISC, запрограммированный siPHK, может затем эндонуклеолитически гидролизовать мРНК-мишени в одном единственном месте примерно в середине комплементарного комплекса siPHK-мРНК. У животных это расщепление катализируется Ago2 «slicer» (см. главу 8). У Arabidopsis эту функцию в трансгенном PTGS выполняет белок AGOl (Baumberger and Baulcombe, 2005). Вслед за нуклеолитическим расщеплением отдельный 3’-фрагмент мРНК деградируется в направлении от 5’ к 3’ концу экзонуклеазой AtXRN4 (Souret et al., 2004), а 5’-фрагмент, по-видимому, гидролизуется экзосомой в направлении от 3’- к 5’-концу.