ta-siPHK приписывают регуляторную роль в определении времени развития растения. Побег цветкового растения во время развития проходит две фазы перемен: вегетативную фазу с переходом от молодого в зрелое состояние побега и репродуктивную фазу, которая сопровождается ростом цветочных ветвей вместо вегетативных (рис. 9.1). В то время как индукция цветения изучена генетически довольно хорошо, вегетативная фаза перемен в побеге исследована гораздо хуже. Один из белков аргонавтов, ZIPPY/AG07, играет специализированную роль в таком фазовом переходе. При скрининге мутантов с преждевременными изменениями в вегетативной фазе развития побега, аналогичных zip, ago7 мутантам, были выявлены два гена (RDR6и SGS3), которые важны для PTGS (рис. 9.36) (Peregrine et al., 2004). Последующий анализ показал, что некоторые гены с контролируемой увеличенной экспрессией у rdrb и sgs3 мутантов замалчиваются посттранскрипционно с помощью ta-siPHK (Vazquez et al., 2004b). Эти данные свидетельствуют о том, что компоненты PTGS важны не только для защиты растения от вирусов и замалчивания трансгенов, но также и для контроля за временем включения пусковых механизмов развития растения. Пока еще не известно, есть ли у животных такие ta-siPHK.
3.4. Путь 3: связанный с трансгенами транскрипционный сайленсинг, направляемое РНК метилирование ДНК и образование гетерохроматина
Современные концепции обусловленного PHKi транскрипционного замалчивания генов выросли из более ранних исследований гомологичного замалчивания генов, запускаемого множественными копиями промоторных областей генома, и из результатов изучения направляемого РНК метилирования ДНК (Matzke and Matzke, 2004). Последующее изучение PHKi-зависимого образования гетерохроматина у делящихся дрожжей (главы 6 и 8) и индуцированных siPHK TGS в клетках млекопитающих заметно расширили представления о филогенетических масштабах этих процессов и подтвердили их перекрывание с PHKi.
Впервые RdDM наблюдали у растений табака, зараженных вироидами (Wassenegger et al., 1994). Вироиды — небольшие патогены растений, содержащие только некодирующие белки циклические РНК, состоящие из нескольких сотен нуклеотидных остатков. В изначальных экспериментах было обнаружено, что реплицирующиеся вироиды запускают de novo метилирование вироидных кДНК, интегрированных в геном табака в качестве трансгенов. При изучении таких трансгенных систем было установлено, что для RdDM необходимы двутяжевые РНК, которые процессируются с возникновением маленьких РНК (признак PHKi). Реплицирующиеся исключительно в цитоплазме РНК-содержащие вирусы индуцируют метилирование гомологичных участков в ядерной ДНК. Это указывало на то, что маленькие РНК, возникающие при PTGS, способны проникать в ядро и индуцировать в нем эпигенетические изменения. Содержащие промоторные последовательности двутяжевые РНК могут направлять метилирование ДНК и вызывать транскрипционное замалчивание узнаваемых ими промоторов-мишеней (Mathieu and Bender, 2004: Matzke et al., 2005).
У растений РНК индуцируют специфическое de novo метилирование цитозиновых остатков в разных нуклеотидных последовательностях ДНК преимущественно в областях комплементарного взаимодействия. Считается, что в результате этого специфического спаривания РНК с ДНК возникает субстрат для de novo метилирования ДНК, однако это еще требует экспериментальных доказательств. В то время как асимметричное CpNpN метилирование не поддерживается после удаления триггерной РНК, симметричные CpG и CpNpG метилирования сохраняются без РНК в области разных промоторов. Различия в эффективности поддерживающих метилирований ДНК могут быть связаны с разным составом нуклеотидных последовательностей или разным характером модификаций гистонов.
Молекулярные компоненты, необходимые для RdDM и TGS, выявлены в результате скрининга соответствующих трансгенов и эндогенных генетических систем. Трансгенные системы транскрибируемых инвертированных повторов или вирусов поставляют двутяжевые РНК, гомологичные соответствующим локусам ДНК-мишеней. В этом отношении информативными эндогенными генами при генетическом скрининге оказались ген фосфорибозилантранилат изомеразы (PAI) (Mathieu and Bender, 2004) и SUPERMAN ген (Chan et al., 2005). Эти гены выполняют роль мишеней или индукторов RdDM и TGS. Например, в семействе из четырех PAI генов два представляют собой инвертированные повторы. Транскрипция инвертированных повторов в области непосредственно вышестоящего промотора приводит к появлению двутяжевых РНК, которые могут специфично связываться с синглетными копиями PAI генов для метилирования ДНК и сайленсинга.