Почти всегда консервативные ДНК-метилтрансферазы и гистон-модифицирующие ферменты необходимы для RdDM (разделы 2.1 и 2.2). De novo метилирование цитозиновых остатков в различных нуклеотидных контекстах катализируется ДНК-метилтрансферазой из класса консервативных DRM ферментов. Консервативная МЕТ1 и специфичная для растений ДНК-метилтрансфераза СМТЗ осуществляют прежде всего поддерживающее метилирование соответственно CpG и CpNpG сайтов, хотя они в небольшой степени могут быть вовлечены и в de novo метилирование. Консервативная гистоновая деацетилаза HDA6 и SWI2/SNF2 белок DDM1 помогают поддерживать CpG метилирование в некоторых локусах. Гистоновая метилтрансфераза KYP/SUVH4 вовлечена в поддержание локус-специфичного CpNpG метилирования, индуцированного РНК (Chan et al., 2005).
К удивлению, недавно было найдено, что для RdDM необходима специфичная для растений РНК-полимераза, называемая pol IV. У всех изученных до сих пор эукариот имеются три ДНК-зависимых РНК-полимеразы (pol 1, pol II и pol III), которые содержат несколько субъединиц, закодированных в определенных генах. Первое свидетельство о существовании pol IV появилось в результате анализа нуклеотидной последовательности ДНК генома, когда были выявлены гены, кодирующие две самые большие субъединицы растительной уникальной, атипичной РНК-полимеразы. Существуют два функционально различных комплекса pol IV с самыми крупными специфичными уникальными субъединицами, каждая из которых взаимодействует с общей для них второй крупной субъединицей, pol IVa необходима для образования siPHK, по-видимому, изначально в результате транскрипции генов-мишеней (Herr et al., 2005; Onodera et al., 2005). RDR2 использует исходный транскрипт в качестве матрицы для синтеза двутяжевои РНК. которая процессируется DCL3 — ядерной активностью, которая специализирована на образовании 24-членных гетерохроматиновых siPHK с транспозонов и повторяющихся последовательностей генома (Xie et al., 2004). После образования siPHK фермент pol IVb вместе со специфичным для растений SWI2/SNF2-noflo6HbiM белком DRD1 формируют сигнал для метилирования ДНК (Kanno et al., 2005), возможно это делается в кооперации с AG04 (рис. 9.3в) (Chan et al., 2005). Пока не известно, действительно ли pol IVb транскрибирует РНК, ее главная роль состоит в формировании структуры хроматина, которая разрешает ДНК-метилтрансферазам катализировать de novo цитозиновое метилирование в определяемых siPHK сайтах. Хотя у других эукариот нет субъединиц pol IV, у делящихся дрожжей две субъединицы pol II, транскрибирующие предшественники мРНК, важны для направленного РНК образования гетерохроматина (главы 6 и 8).
Несмотря на то, что направленные на промотор siPHK могут индуцировать TGS в человеческих клетках, пока еще точно не ясно, сопровождается ли это заметным метилированием ДНК (Kawasaki et al., 2005; Ting et al., 2005). Многие белки, необходимые для RdDM у растений, найдены только у представителей растительного мира (рис. 9.3в). Таким образом, если RdDM и происходит регулярно у млекопитающих, его механизмы и белковые участники должны быть иными, чем у растений.
Многие транспозоны и повторяющиеся последовательности ДНК, включая наборы 5S рДНК и богатые транспозонами области гетерохроматина в хромосоме 4 Arabidopsis замалчиваются транскрипционно и метилируются по PHKi-направляемому механизму (Lippman and Martienssen, 2004; Chan et al., 2005). Эндогенные ДНК-мишени отражают естественную роль РНК-направляемого TGS в подавлении транспозиции и упаковке нуклеотидных повторов в гетерохроматине. Однако содержащие вставки транспозонов растительные гены могут сами по себе становиться мишенями направляемых PHKi сайленсинга и метилирования ДНК. Например, возникшие из транспозонов повторы в промоторе FWA гена цветка Arabidopsis служат мишенями для соответствующих siPHK (Lippman and Martienssen, 2004) и осуществляют замалчивание этого гена в вегетативных тканях, где его работа вовсе не нужна. У некоторых растений Arabidopsis элемент Ми в интроне FLC гена (репрессор цветения) делает этот ген доступным для репрессивных модуляций хроматина, направляемых siPHK, возникшими из диспергированных копий Ми (Liu et al., 2004). В результате сниженная экспрессия гена FLC может ускорять цветение, что может иметь адаптивное значение при определенных условиях среды. Поскольку многие растительные гены имеют транспозонные вставки в области или поблизости от промоторов или в интронах, такая регуляция генной активности может быть довольно распространенной в мире растений. Чем больше мы узнаем об эпигенетической регуляции, тем все более подтверждается идея Барбары МакКлинток о том, что транспозоны действуют как контрольные элементы хозяйских генов и развития (McClintock, 1956).