Как представляют себе влияние HPTMs на регуляцию и функционирование генома? Обычно рассматриваются три механизма, и полезно держать эти механизмы в голове, поскольку в этой главе представлены обширная информация и данные по истории HPTMs. Во-первых, HPTMs могут каким-то образом влиять на структуру хроматина —например, предотвращая ключевые контакты, облегчающие образование определенных конформаций хроматина или структур более высокого порядка (что может рассматриваться как cw-модифицирующие эффекты). Напротив, два других механизма считаются действующими в trans-конфигурации. HPTMs могут разрушать связывание белков, которые ассоциируются с хроматином или гистонами. Или же HPTMs могут создавать измененные связывающие поверхности, которые притягивают определенные эффекторные белки. Этот третий механизм был охарактеризован наиболее детально, и такое рекрутирование белков определяется по отношению к его функциональным последствиям: так, оно может иметь активирующее или же репрессивное влияние на транскрипцию. Большое число обнаруженных HPTMs и их разнообразные комбинации привели к мысли, что HPTMs осуществляют регуляцию посредством комбинаторных паттернов, во временных последовательностях, и могут устанавливаться на коротких и длинных расстояниях. Эти разнообразные механизмы определяют разные функциональные результаты — одни из них временные, преходящие, другие стабильные и эпигенетически наследуемые.
В 1960-е годы Винсент Олфри (Vincent Allfrey) идентифицировал ацетилирование, метилирование и фосфорилирование гистонов, выделенных из многих эукариот. Гистоны были также первыми распознанными убиквитилированными белковыми субстратами. Тем не менее, хотя Олфри и наблюдал определенные корреляции между модификациями и источником транс-крипционно активного хроматина, генетические и функциональные доказательства в пользу роли HPTMs в регуляции генов были получены значительно позже. Действительно, многие исследователи, изучавшие биохимию и генетику регуляции генов в 1980-е и 1990-е годы, скептически относились к мысли, что HPTMs играют причинную роль в регуляции генов
1. Гистоны и ацетилирование играют регуляторную роль в транскрипции
Как показано в этой главе, гистоны подвержены многим разным посттрансляционным модификациям (PTMs), и со временем несомненно будут обнаружены новые, пока еще не известные HPTMs. Известные модификации можно классифицировать либо как малые химические группы, обсуждаемые в разделах 2—4 этой главы, либо как более крупные пептидные изменения в гистонах, что обсуждается в разделе 5 (табл. 10.1). Механизм, посредством которого HPTMs влияют на хроматиновую матрицу и родственные процессы, такие как транскрипция или репрессия генов, рассматриваются в контексте трех концептуальных моделей, изображенных на рис. 10.1. Модель 1 предполагает, что посттрансляционно модифицированные гистоны могут каким-то образом изменять струкутру хроматина. В модели 2 НРТМ может подавлять связывание некоего фактора с хроматиновой матрицей, тогда как модель 3 предполагает, что НРТМ создает сайт связывания для определенного белка (см. также раздел 5 главы 3).
Что, в историческом плане, изменило главенствующий взгляд, согласно которому хроматин является, в основном, материалом упаковки ДНК? Самые ранние
HPTMs разбиваются на две группы: группа 1 представляет модификации малыми химическими группами, а группа 2 включает более крупные химические модификации данные о том, что HPTMs регулируют активацию транскрипции и сайленсинг, были получены в экспериментах на Saccharomyces cerevisiae в конце 1980-х годов. Эти почкующиеся дрожжи являются весьма эффективной моделью для проведения генетических экспериментов (в области как прямой, так и обратной генетики) по выяснению значения гистонов. Причина этого в том, что, в отличие от высших эукариот, где имеются множественные копии каждого гистонового гена, с однокопийными гистоновыми генами дрожжей можно легко проводить генетические манипуляции. Например, на фоне удаления с помощью делеций всех гистоновых генов можно ввести копию каждого гена, закодированную в эписоме, несущей такой селективный маркер, как ген URA3, для сохранения этой эписомы. Вторую копию гистонов можно ввести на второй эписоме, несущей другой селективный маркер. В этой второй копии можно вызвать мутацию с помощью сайт-направленного мутагенеза, а затем можно вызвать утерю первой копии, копии дикого типа, из клетки, используя 5-FOA (5-фтороротовая кислота), делающую продукт гена URA3 токсичным для клетки. Конечным результатом будет присутствие в клетке единственной копии — измененной копии на второй эписоме, которая содержит любое число мутаций, подлежащих тестированию. У S. cerevisiae гистоновые гены расположены парами H3/ Н4 и Н2А/Н2В, и их транскрипция в большой степени скоординирована таким образом, что совпадает с фазой S. Каждая нуклеосома собирается из тетрамера H3/Н4 и двух димеров Н2А/Н2В; когда одна пара любой двойки оказывается недо- или сверхтранскрибированной, нуклеосомы оказываются обедненными. Это изменение дозы гистонов генетическими средствами явилось одним из первоначальных доказательств того, что структура хроматина играет ключевую роль в регулировании экспрессии. Один такой подход использовал «прямую» генетику, когда были отселектированы случайные мутации, которые приводили к инактивации гена-маркера (Clark-Adams et al., 1988). Оказалось, что эти мутации изменяют количество пар гистонов. При втором подходе использовали «обратную» генетику, когда направленное «истощение» гистоновых генов давало четкое доказательство того, что гистоны регулируют транскрипцию генов (Han and Grunstein, 1988). Следующий этап заключался в том, чтобы провести делецию только аминотерминальных «хвостов» гистонов (сайты локализации многих НРТМ) или выполнить мутации-замены сайтов ацетилирования в гистонах. Эти более тонкие «хирургические» изменения также вызывали уменьшение активации генов, позволяя предполагать, что ацетилирование необходимо для транскрипции генов (Durrin et al., 1991).