Рис. 10.1. Модели, показывающие, каким образом посттрансляционные модификации гистонов влияют на хроматиновую матрицу
Модель 1 предполагает, что изменения в структуре хроматина опосредуются cis-эффектами ковалентных модификаций гистонов, таких как ацетилирование или фосфорилирование гистонов. Модель 2 иллюстрирует подавляющее влияние НРТМ на связывание ассоциированного с хроматином фактора (CF) на примере фосфорилирования по H3S10, блокирующего связывание НР1 в метилированном H3K9. В модели 3 НР1М может обеспечивать специфичность связывания для ассоциированного с хроматином фактора Классическим примером является связывание НР1 через посредство его хромодомена с метилированным H3K9
При других подходах исследовали, изменяются ли нуклеосомы естественным образом в ходе активации генов. Биохимические эксперименты показали, что нуклеосомы играют репрессивную роль в транскрипции на матрицах ДНК in vitro (Workman and Roeder, 1987), но вопрос о том, происходит ли то же самое in vivo, является спорным. Некоторые промоторы обладают нуклеосомами, расположенными естественным образом «вверх по течению» от сайтов начала транскрипции, и эти позиционированные нуклеосомы становятся измененными, когда ген активируется (Svaren et al., 1994; Shim et al., 1998). В случае PH05 изменение нуклеосом требовало активатора, показывая тем самым, что без транскрипции нуклеосомы не были изменены. Однако было неясно, является ли это изменение причиной или же следствием транскрипции. Чтобы выяснить это, делетировали ТАТА-бокс, отменяющий транскрипцию у дрожжей. Положение нуклеосом, тем не менее, изменилось, заставляя предположить, что это изменение нуклеосом предшествует транскрипции.
В совокупности подобные эксперименты убедительно свидетельствовали о том, что для активации транскрипции могут быть необходимы и репозиционирование нуклеосом, и ацетилирование специфических остатков в гистоновых «хвостах»
2. Ацетилирование и деацетилирование
Дополнительные экспериментальные подходы продолжали поставлять данные о том, что ацетилирование (versus отсутствие ацетилирования) коррелирует с транскрипцией. Районы, транскрипционно активные или готовые к транскрипции, склонны иметь «открытую» конфигурацию хроматина и поэтому доступны для таких ферментов, как ДНКаза и MN-ase, которые при добавлении к изолированным, но интактным ядрам могут переваривать ДНК. В начале 1990-х годов исследователи начали использовать иммунопреципитацию хроматина (ChIP, chromatin immunoprecipitation) — мощный метод для анализа того, какие белки связываются с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК in vivo. Этот метод включает создание поперечных сшивок в белках, связанных с ДНК, с помощью таких проникающих в клетку химических реагентов, как формальдегид, и последующую обработку ультразвуком для разрушения комплексов ДНК:белок до более мелких фрагментов. Интересующие исследователя комплексы ДНК:белок затем подвергаются иммунопреципитации с использованием специфических антител в качестве зонда. Затем поперечные сшивки ликвидируются, чтобы изолировать и идентифицировать нуклеотидные последовательности ДНК, ассоциированные с белком, который связался с антителом; при этом для анализа используется либо радиоактивно меченые ДНК-зонды, либо ПЦР Одна группа использовала этот метод, чтобы исследовать корреляцию между сайтами в ДНК вокруг активных глобиновых генов, которые гиперчувствительны к перевариванию ДНКазой и ассоциируются с ацетилированными гистонами в эритроцитах курицы; корреляция оказалась очень тесной (Hebbes et al., 1994). У S. cerevisiae аналогичные подходы были применены в транскрипционно «молчащих» районах генома, и были показаны очень низкие уровни ацетилирования гистонов (Braunstein et al., 1993). Наоборот, генетическое нарушение сайленсинга коррелировало с увеличенным ацетилированием.