Все эти эксперименты постепенно обнаруживали, что гистоны и, в частности, сайты обратимого ацетилирования играют роль в регуляции генов. Однако первые ферменты ацетилирования и деацетилирования ядерных гистонов не были идентифицированы вплоть до середины 1990-х годов, и они явились наиболее прямым доказательством того, что эти ферменты играют роль в ходе транскрипции. Первая ядерная ацетилтрансфераза гистонов (HAT) была выделена из так называемого макронуклеуса (очень крупного транскрипционно активного ядра в отличие от мейотического микронуклеуса) инфузории Tetrahymena, который характеризуется высокими скоростями транскрипции (Brownell et al., 1996). Ключевым подходом для выявления активности HAT оказался анализ «в геле» («in-gel»): сложная смесь белков из клеточных экстрактов была разделена на пропитанном гистонами SDS-геле, затем пептиды были подвергнуты ренатурации, и белки с активностью фермента HAT метили этот гель путем переноса радиактивно меченного кофактора, ацетилкоэнзима А, на локализованные гистоны. Это делало возможным последующее биохимическое фракционирование и очистку этого полипептида. Идентифицированный энзим HAT был гомологичен ранее изолированному у S. cerevisiae коактиватору, называемому Gcn5, о котором было известно, что он взаимодействует с транскрипционными активаторами. Одновременно первая деацетилаза гистонов (HDAC) была выделена посредством биохимической очистки (Taunton et al., 1996). В этом случае фермент был очищен из клеточных экстрактов с помощью ингибитора, связанного с нерастворимым матриксом, который физически связывался с каталитическим сайтом фермента. Энзим оказался гомологичным ранее выделенному гену, игравшему роль кофактора в репрессии генов. Эти замечательные параллельные открытия первых ферментов, которые, как оказалось, метаболизируют ацетильные группы на гистонах, привели к модели, которая в настоящее время стала парадигмой для ген-специфичных гистоновых PTMs: связанные с ДНК активаторы рекрутируют HATs для того, чтобы ацетилировать нуклеосомные гистоны, тогда как репрессоры рекрутируют YDACs для того, чтобы деацетилировать гистоны. Эти изменения ведут к изменениям нуклеосомы и, соответственно, к ап- или даун-регуляции гена (рис. 10.2).
Было показано, что многие другие хорошо известные коактиваторы и корепрессоры обладают активностью HAT или HDAC или ассоциируются с такими энзимами (Sterner and Berger, 2000; Roth et al., 2001). Более того, ферментативные активности HATs и HDACs являются критическими для их роли в активации и репрессии генов. Эти энзимы часто являются компонентами крупных комплексов, модулярных по структуре и функции; модифицирующая гистоны ферментативная активность — это только одна функция, и в числе других, например, рекрутирование связывающегося с ТАТА белка (TBR TATA-binding protein) (Grant et al., 1998). Интересно, что некоторые ядерные рецепторы гормонов функционируют и как связывающиеся с ДНК репрессоры транскрипции (когда они не связаны с гормонами-лигандами), и как активаторы транскрипции (когда связаны с гормонами-лигандами); эти рецепторы осуществляют эти функции отчасти через посредство РТМ хроматиновых участков-мишеней, рекрутируя HDACs, когда они не связаны с лигандами, и HATs, когда связаны (Baek and Rosenfeld, 2004).
Рис. 10.2. Энзимы, модифицирующие гистоны, рекрутируются к промоторам связывающимися с ДНК транскрипционными факторами
Ацетилтрансферазы гистонов (HAT) рекрутируются активаторами, которые связываются с активирующими нуклеотидными последовательностями «вверх по течению» (UAS, upstream activating sequences). Этот фермент катализирует ацетилирование локальных гистонов, которые, как известно, вносят вклад в активацию транскрипции. Деацетилазы гистонов (HDAC) рекрутируются репрессорами транскрипции, которые связываются с репрессивными нуклеотидными последовательностями «вверх по течению» (URS) и деацетилируют локальные гистоны Это вносит вклад в репрессию транскрипции