Исследования H3.3 в основной массе хроматина показали, что активные фракции обогащены им (Henikoff and Ahmad, 2005). Однако разнообразные факторы вносили свой вклад в ситуацию неопределенности с этой потенциальной «меткой» активного хроматина во времена великого возбуждения в хроматиновой области, когда осознали, что модификации гистонов могут отличать активный хроматин от «молчащего». Прежде всего, отсутствовали какие-либо антитела, которые могли бы эффективно отличать H3 от H3.3 в хроматине (позиции 87—90 блокированы спиралями ДНК в нуклеосоме), тогда как превосходные антитела против многих посттрансляционных модификаций были легко доступными. Кроме того, различия по последовательности между H3 и H3.3, казавшиеся незначительными, не предполагали каких-либо фундаментальных различий в хроматине, тогда как модификации гистонов были главным образом по лизинам «хвостов», о которых было известно, что они влияют на взаимодействия хроматина или связывают ассоциированные с хроматином белки. Ощущение, что эти две формы гистона 3 должны быть взаимозаменяемыми, получило подтверждение в открытой у Tetrahyтепа возможности замены S-фазной формой гистона ее замещающего аналога. Наконец, влиятельная гипотеза «гистонового кода» представляла нуклеосомы как фиксированные мишени модификационных ферментов во время дифференцировки хроматина (Jenuwein and Allis, 2001). Однако становилось все более и более очевидным, что хроматин является высокодинамичным, и даже ассоциированные с гетерохроматином белки связываются с местами своего нахождения на минуты или даже менее (Phair et al., 2004). Оказывается, хроматин активно транскрибируемых генов находится в состоянии постоянного изменения, характеризующемся непрерывным замещением гистонов (Henikoff and Ahmad, 2005). Три коровых различия, отличающие H3 от H3.3, делают димеры H3.3•Н4 субстратом для RI-сборки, и сама по себе RI-сборка глубоко изменяет хроматин. В результате этого процесса активно транскрибируемые участки становятся маркированными H3.3 (рис. 13.6), и доказательства в пользу этого процесса следуют из наблюдения RI-замещения H3, метилированного по лизину 9 (H3K9me) меченым H3.3 [with tagged H3.3] в транскрибируемых PH К-полимеразами I и II (pol I и II) локусах (Schwartz and Ahmad, 2005).
Результатом динамичной природы хроматина в активных локусах является стирание предсуществовавших модификаций гистонов. Этим обеспечивается потенциальное решение вопроса о том, каким образом «молчащий» хроматин может становиться активированным, когда он гиперметилирован по H3K9 и H3K27 (модификации гистонов, обычно ассоциированные с репрессивным хроматином). Исследования временной динамики показали, что метилы на гистонах столь же стабильны, как и сами гистоны (Waterborg, 1993), хотя недавнее открытие деметил азы, специфичной для моно- и диметилированного H3K4 (Shi et al., 2004), показывает, что некоторые метальные группы могут энзиматически удаляться с гистонов. В целом, паттерны ковалентных модификаций гистонов могли бы быть результатом модификаций, уже присутствующих на гистонах в то время, когда они откладываются. Таким путем модифицирующие ферменты шли бы по уже проложенному следу вместе с машиной сборки, возможно облегчая этот процесс (Henikoff and Ahmad, 2005).
Рис. 13.6. H3.3 предпочтительно локализуется в активно транскрибируемых участках политенных хромосом Drosophila
Окрашивание DAPI (красный цвет) показывает паттерн бэндинга ДНК (слева), и H3.3-GFR (зеленый цвет) локализуется в междисковых промежутках (средняя часть), которые являются сайтами локализации РНК-полимеразы II. Правая часть рисунка — совмещение (перепечатано из: Schwartz and Ahmad, 2005)
Эта модель динамической сборки предсказывает, что модификациями гистонов, которыми обогащен активный хроматин, должен быть обогащен и H3.3, и большинство измерений модификаций в H3 и H3.3 показали, что так оно и есть и у растений, и у животных. Более того, на основании этой модели ожидается, что активные модификации лизинов, такие как ацетилирование H3 и Н4 и метилирование H3K4 и H3K79, будут сильно коррелировать друг с другом, как наблюдалось в разных системах (O’Neill et al., 2003: Kurdistani et al., 2004; Schubeler et al., 2004). Наконец, динамическая RI-сборка в активных генах может объяснить, почему мутации CAF-1 вызывают утрату сайленсинга (Loyola and Almouzni, 2004): считается, что лишь около 10 % генома дрожжей находится в «молчащем» состоянии, и это, возможно, единственный хроматин, который не замещается динамически в геноме дрожжей. В отсутствие опосредуемой CAF-1 RC-сборки RI-сборка происходила бы по всему геному дрожжей, активируя прежде «молчащие» районы. Возможно, существование варианта H3, предназначенного для RC-сборки у многоклеточных эукариот, является адаптацией для удержания подавляющей части хроматина клетки в эпигенетически «молчащем» состоянии