Чередование [interspersion] доменов H3 и CENP-A ставит ключевые вопросы относительно эпигенетической природы CEN-хроматина. В частности, модифицированы ли субдомены H3 в CEN-хроматине многоклеточных эукариот подобно гетерохроматину или эухроматину? Или же они маркированы уникальным образом? Далее, эквивалентна ли каждая перемежающаяся единица CENP-A/H3 в более крупных эукариотических центромерах единичной центромере S. pombe? К этим вопросам обратились, изучая посттрансляционные модификации, характеризующие перемежающиеся блоки нуклеосом H3 и CENP-A и обнаружившие еще большую сложность. Удивительно, что у человека и мух перемежающиеся домены H3 содержат H3K9me2 — метку, обычно ассоциированную с эухроматином — и, более того, не имеют H3K9me2 и H3K9me3, ассоциированных с фланкирующим гетерохроматином (рис. 14.7а) (Sullivan and Karpen, 2004; Lam et al., 2006). Однако, как и в гетерохроматине, в перемежающихся нуклеосомах H3 отсутствовали множественные формы ацетилирования H3 и Н4, как отсутствовал и H3K4me3. Таким образом, нуклеосомы H3 в CEN-хроматине обнаруживают паттерн модификаций, отличающийся от канонических эухроматина или гетерохроматина (рис. 14.76). Эти результаты наводят также на мысль, что центросомы мух и человека не составлены просто из повторяющихся S. pombe-подобных центромер. Важно, однако, отметить, что общая организация центромерных районов консервативна, так что у всех многоклеточных эукариот и у S. pombe весь хроматиновый домен CENP-A фланкируется перицентромерным гетерохроматином, содержащим метилирование H3K9.
Какова возможная функциональная роль модификаций гистонов в CEN и фланкирующем хроматине? Отдельные состояния хроматина в районе CEN, вероятно, вносят вклад в разнообразные свойства центромерных доменов, такие как установление сроков для дифференциальной репликации CEN и фланкирующего гетерохроматина (Sullivan and Karpen, 2001; Blower et al., 2002). Модификации фланкирующего перицентромерного гетерохроматина могут также поддерживать размеры центромер, создавая барьер против расширения CEN-хроматина. У Drosophila CEN-хроматин легко распространяется на соседние последовательности, когда фланкирующий гетерохроматин удаляется, делая возможной активацию неоцентромеры (рис. 14.56) (Maggert and Karpen, 2001), а сверхэкспрессия CENP-A приводит к неправильной локализации в эухроматин, но не гетерохроматин (Heun et al., 2006). Интересно, что результатом сверхэкспрессии CENP-A в клетках человека является распространение CEN -хроматина и изменения в метилировании H3K9 во фланкирующих участках (Lam et al, 2006). Таким образом, размеры центромер, по-видимому, определяются балансом между двумя эпигенетическими состояниями: CEN-хроматином и фланкирующим перицентромерным гетерохроматином.
Концентрация белков, необходимых для сцепления (когезии) сестринских хроматид, которое устанавливается одновременно с репликацией ДНК в фазе S, выше всего в гетерохроматине, фланкирующем центромеру. Это распределение, по-видимому, вносит вклад в соответствующую двойную ориентацию кинетохоров в митозе, а также в поддержание сцепления во время метафазы несмотря на развиваемые веретеном силы, концентрирующиеся в кинетохорах/центромерах (Watanabe, 2005). Эпигенетическое регулирование сцепления включает рекрутирование когезинов белками НР1 (Swi6у S. pombe), которое, в свою очередь, опосредуется высокими концентрациями метилирования H3K9 в перицентромерном гетерохроматине (Nonaka et al., 2002). Таким образом, специфичные для CEN комбинации модификаций гистонов тоже могли бы быть важными для рекрутирования когезионных комплексов к гетерохроматину вблизи сестринских кинетохоров, обеспечивая в то же время пространственное разделение когезионных и кинетохорных доменов (Sullivan and Karpen, 2004; см. также главу 6).
Рис. 14.7. Различные паттерны модификаций гистонов в центромерном хроматине
(а) Иммунофлуоресцентный анализ с использованием антител, распознающих специфические модификации гистонов на расправленных хромосомных фибриллах, показал, что перемежающиеся блоки нуклеосом, содержащих H3, обладают паттерном модификаций, отличающимся от канонических эухроматина и гетерохроматина (Sullivan and Karpen, 2004). Например, несмотря на то, что центромеры у большинства эукариот погружены в крупные блоки перицентрического гетерохроматина, перемежающиеся блоки H3 содержат модификацию H3K9me2, в норме ассоциирующуюся с «открытым» эухроматином (наверху) и лишены гетерохроматинового маркера H3K9me2, присутствующей в перицентрических фланкирующих участках (внизу), (б) Сводка «двумерной» организации центромерного хроматина в интерфазе, основывающаяся на исследованиях растянутых фибрилл хроматина у мух и человека. + и — обозначают присутствие и отсутствие указанных модификаций гистонов (соответственно) в эухроматине, перицентромерном гетерохроматине и перемежающихся блоках нуклеосом H3 в центромерном хроматине (Sullivan and Karpen 2004; Lam et al., 2006). (в) Модель трехмерной организации хроматина в центромерном районе митотических хромосом. Предполагается, что ассоциации между сходным образом модифицированными нуклеосомами вносят вклад в формирование отдельных трехмерных структур в центромерном и фланкирующем хроматине. Перемежающиеся CENP-A/ CID и по-разному модифицированные H3 и Н4 могут опосредовать формирование «цилиндрических» трехмерных структур, наблюдаемых в метафазных хромосомах (Blower et al., 2002; Sullivan and Karpen, 2004). Хроматин H3K9me2, рекрутирующий такие белки гетерохроматина, как НР1, и такие белки когезии, как RAD21/SCC1, присутствует во внутреннем кинетохорном пространстве между митотическими сестринскими хроматидами и в участках, фланкирующих центромерный хроматин. Это расположение может быть необходимо для «презентации» CENP-A направленной к полюсу поверхности митотической хромосомы и облегчения рекрутирования внешних кинетохорных белков, а также для стимуляции взаимодействия НР1 с самим собой и правильной конденсации/когезии хромосом. Когезины изображены в виде кольцевидных структур в соответствии с последними моделями