Как комплекс MSL связывается с Х-хромосомой и что он распознает? В отсутствие обеих РНК roX или же либо MLE, MSL3, либо MOF частичные комплексы MSL связываются с подгруппой из 35—70 сайтов (рис. 16.6). Эти «высокоаффинные» сайты сравнили у мутантов mle, msl3 и mof и нашли, что на цитологическом уровне они в большой мере одинаковы, но их молекулярная идентичность пока еще неизвестна. Ключевым дефектом у мутантов mle может быть их неспособность инкорпорировать РНК roX в частичные комплексы, поскольку эти РНК ко-локализуются вместе с частичными комплексами в отсутствие MSL3 или MOF, но не в отсутствие MLE (Meller et al., 2000). В отсутствие либо MSL1, либо MSL2 ни один из остальных белков MSL или РНК roX не сохраняет способность распознавать Х-хромосому, что приводит к предположению, что MSL1 и MSL2 совместно обеспечивают по крайней мере первоначальную специфичность «нацеливания» на X. Тем не менее, ни один из этих белков не несет известный ДНК-связывающий мотив, и связывание с ДНК in vitro не было продемонстрировано.
Рис. 16.6. «Высокоаффинные» сайты
Препараты хромосом слюнных желез из личинок, несущих аллель типа «утраты функции» гена msl3 (а, б), или из контрольных личинок дикого типа (в. г). На а и г показаны изображения, полученные с фазовым контрастом, тогда как на б и в показаны те же хромосомы с иммуноокрашиванием на присутствие комплекса. На б комплекс (зеленый цвет) обнаруживается в меньшем числе сайтов, чем на в (перепечатано, с любезного разрешения, из: Demakova et al., 2003 [©Springer]
Что же могло бы быть сигналом специфичности на Х-хромосоме, что привлекало бы этот комплекс? Можно представить себе две очень общие модели регулирования целой хромосомы. Одиночный сайт или ограниченное число сайтов могли бы контролировать хромосому в cis-конфигурации, как это имеет место в случае Х-инактивации у млекопитающих (глава 17). Этот механизм требует либо компартментализации комплекса в специфическом месте ядра, либо регулирования на очень больших расстояниях посредством распространения факторов из центрального района на остальные части хромосомы. В соответствии с другим крайним вариантом, хромосома могла бы иметь уникальные идентифицирующие последовательности, разбросанные по всей ее длине. В этом случае любой сегмент хромосомы мог бы регулироваться автономно. Между этими двумя моделями находится целый спектр возможностей, включая комбинацию центральных контрольных районов с диспергированными последовательностями, которые облегчают регуляцию на больших расстояниях.
РНК roX в норме кодируются Х-хромосомой: ген roX1 находится возле ее конца, а ген roX2 — около середины эухроматической части Х-хромосомы. Подобно гену Xist у млекопитающих гены roX могут находиться на Х-хромосоме для того, чтобы «нацеливать» сборку комплекса MSL на эту хромосому. Когда гены roX перемещаются на аутосомы как трансгены, они энергично привлекают белки MSL к новым сайтам, в которые произошла вставка (рис. 16.7), где этот комплекс, по-видимому, распространяется в cis-конфигурации на разные расстояния во фланкирующие последовательности (Kelley et al., 1999; Kageyama et al., 2001). В специфических генетических условиях, например когда на Х-хромосоме нет конкурирующих эндогенных генов roX, неизменно наблюдается экстенсивное распространение с аутосомных трансгенов roX (рис. 16.7) (Park et al., 2002). Это экстенсивное распространение усиливается сверхэкспрессией MSL1 и MSL2, ключевых лимитирующих белков MSL, и уменьшается сверхэкспрессией РНК roX с конкурирующих трансгенов, позволяя предполагать, что успешная ко-транскрипционная сборка комплексов MSI может управлять локальным распространением (Oh et al., 2003). Эффективная сборка функциональных комплексов MSL в ядре может быть первичной функцией РНК roX. Первоначальная сборка в генах roX на Х-хромосоме должна, вероятно, усиливать эффективность «нацеливания» на Х-хромосому, но очевидно не является существенной для окончательного «нацеливания», поскольку гены roX могут функционировать в trans-конфигурации (Meller and Rattner, 2002)