Второй элемент, который у мышей может влиять на выбор, — это антисмысловой регулятор Tsix (Lee and Lu, 1999). Полагают, что он опосредуется антисмысловой РНК Tsix, которая транскрибируется через локус Xist перед инициацией случайной Х-инактивации (рис. 17.6). Хромосома, несущая делецию промотора Tsix, в клетках XX, претерпевающих случайную Х-инактивацию, инактивируется предпочтительно. Более слабые отклонения наблюдаются у клеток с мутациями в энхансерных элементах (Xite-элементах), которые могут управлять уровнями экспрессии Tsix. Хотя промотор Tsix лежит в пределах района, определяющего предполагаемый сайт связывания блокирующего фактора, опыты с «прицельными» делециями не активируют Xist «по умолчанию» в ES-клетках XY. Это позволяет предположить, что эти локусы не синонимичны, но что делеция промотора Tsix оставляет интактными сайты связывания для блокирующего фактора.
Транскрипция Tsix сопровождается транскрипцией Xist, идущей на низком уровне, перед инициацией случайной Х-инактивации, позволяя предполагать, что влияние на выбор может быть опосредовано двунитевой РНК (т. е. гибридными нитями Tsix: Xist). В согласии с этим повышение уровня смысловой транскрипции через промоторы Xist находится в противоречии с репрессивным эффектом Tsix и дает в результате аллель с меньшей вероятностью стать активной X в гетерозиготной клетке XX (Nesterova et al., 2003). Подытоживая этот материал, можно сказать, что на рис. 17.6 показаны все различные Xic-элементы, о которых известно, что они влияют на инициацию случайной и импринтированной Х-инактивации, и которые часто описываются с точки зрения их способности влиять на функции счета и (или) выбора.
Рис. 17.6. Гены и регуляторные элементы в районе центра Х-инактивации
Ключевой район, регулирующим Х-инактивацию, изображен зеленым цветом. Фланкирующие гены показаны серым цветом Стрелки указывают на промоторы генов Xist (смысловой) и Tsix (антисмысловой). Протяженность соответствующих некодируюших РНК изображена прерывистыми зелеными линиями. Регуляторные элементы, контролирующие экспрессию Tsix, Xite и DXPas34, показаны черным. Районы и локусы, участвующие в выборе Х-хромосомы и счете Х-хромосом, показаны в верхней части рисунка
3.5. Способы переключения инактивации в раннем эмбриогенезе
Каким образом ранние эмбрионы мыши осуществляют переключение с импринтированного на случайный способ регуляции? До недавнего времени думали, что в обоих случаях инициация Х-инактивации сцеплена с клеточной дифференцировкой (Monk and Harper, 1979). Так, полагали, что линии трофэктодермы и примитивной эндодермы инактивируют Хр в ответ на родительские импринты на Xist, когда они впервые дифференцируются на стадии бластоцисты, в то время как клетки ICM, дающие начало собственно эмбриону, сначала, как думали, стирают импринт Xist, а потом претерпевают случайную Х-инактивацию, когда они дифференцируются в три зародышевые линии на стадии гаструляции. Однако более свежие данные показывают, что инактивация ХР происходит до начала клеточной дифференцировки на стадии дробления зародышей и что она происходит во всех клетках, включая предшественников ICM (Мак et al., 2004; Okamoto et al., 2004). Таким образом, импринтированная Х-инактивация в трофэктодерме и примитивной эндодерме представляет собой реликт паттерна Х-инактивации, устанавливаемого у эмбрионов на стадии раннего дробления. Клетки ICM должны, таким образом, запускать программу для реверсии этой начальной волны импринтированной Х-инактивации (см. рис. 17.4). База для реверсии инактивации Хр неизвестна, но может включать в себя специфичную для ICM программу, которая репрессирует экспрессию Xist на Хр (см. раздел 5).
4. Воспроизведение и поддержание неактивного состояния
4.1. Xist-PHK, сайленсинг генов и сборка гетерохроматина
Так что же делает ген Xist? Имеются убедительные данные, что ген Xist и его продукт, РНК, обеспечивают как переключатель, инициирующий Х-инактивацию в cis-конфигурации, так и средство распространения сайленсинга по хромосоме. Данные показывают, что (1) Xist уникален в том отношении, что он экспрессируется только с Xi, (2) уровни Xist-РНК резко возрастают у предимплантационных эмбрионов во время Х-инактивации, (3) ап-регуляция Xist предшествует Х-инактивации и, по-видимому, является абсолютно необходимой для нее, (4) Xist-РНК колокализуется с Xi в интерфазных ядрах и распределяется по одной из двух метафазных Х-хромосом (см. рис. 17.3) и (5) содержащие Xist трансгены, будучи вставлены в аутосомы, могут индуцировать по крайней мере некоторые свойства неактивного хроматина. В результате (сверх)экспрессии аутосома в cis-конфигуpaции покрывается продуктом, и параллельно возникает подобная гетерохроматину, транскрипционно «молчащая» структура хроматина (Heard et al., 1999 и помещенные там ссылки). Эти открытия заставляют предположить, что Xist-РНК и необходима, и достаточна для включения формирования гетерохроматина и транскрипционного сайленсинга. Однако продолжающаяся экспрессия Xist не требуется для поддержания Х-инактивации. Например, у гибридов соматических клеток человека и грызуна, где экспрессия Xist утрачена на Xi-хромосоме человека, которая сохраняется на фоне хромосом грызуна, поддерживается сайленсинг генов, сцепленных с Х-хромосомой (Brown and Willard, 1994). Эта тема обсуждается далее, в разделе 5.