Важно отметить, что ассоциация Xist-PHK с Xi избирательна. Она не обнаруживается вдоль PAR (которое остается активным и эухроматиновым) или в конститутивном (центрическом) гетерохроматине. Более того, анализ метафазных хромосом демонстрирует локализацию в виде бэндов, которая, по-видимому, коррелируете G-светлыми полосами (бэндами), обогащенными генами (см. рис. 17.3) (Duthie et al., 1999). Эти наблюдения показывают, что Xist-РНК покрывает лишь определенные районы хроматина (обсуждается далее в разделе 4.5)
Механизм (механизмы), посредством которого Xist-PHK осуществляет изменения в структуре хроматина и связанный с ним сайленсинг генов в деталях остаются все еще непонятными. Мы знаем, что разные участки молекулы Xist-PHК ответственны за сайленсинг генов и распространение вдоль Х-хромосомы. Эксперименты с системой индуцибельной экспрессии Xist в мышиных ES-клетках, в которой можно было протестировать функции молекул Xist, несущих определенные делеции, показали, что сайленсинг можно приписать консервативной повторяющейся последовательности на 5’-конце этой молекулы, тогда как покрытие Х-хромосомы опосредуется последовательностями, разбросанными по всей остальной части молекулы (Wutz et al., 2002).
4.2. Гетерохроматиновая структура неактивной Х-хромосомы
Со времени самых ранних светомикроскопических исследований вполне осознавали, что Xi обладает свойствами, общими с гетерохроматином. Подобно конститутивному гетерохроматину, обнаруживаемому в центромерах и вокруг них, Xi остается видимой и, вероятно, конденсированной на протяжении всей интерфазы (в виде тельца Барра), и ее ДНК обычно реплицируется в поздней фазе S. Говорится, что Xi состоит из факультативного гетерохроматина. Однако важно помнить, что ДНК конститутивного гетерохроматина обычно обогащена специфическими, повторяющимися сателлитными последовательностями, которые ответственны, по крайней мере частично, за его характерные свойства. ДНК Х-хромосомы не обнаруживает подобной обогащенности, хотя и демонстрирует более слабые различия в специфических повторяющихся элементах, которые могут играть роль в процессе инактивации (см. раздел 4.5). Кроме того, хотя хроматин Xi часто описывается как «конденсированный», тщательный микроскопический анализ и ЗБ-реконструкция хромосом Ха и Xi, помеченных специфичным к ДНК Х-хромосомы зондом, позволяют предполагать, что различие между ними является в большей мере вопросом формы, чем количества хроматина на единицу объема (Eils et al., 1996).
Дальнейшие параллели между Xi и конститутивным гетерохроматином последовали в результате использования непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии для изучения распределения модификаций и вариантов гистонов по метафазным хромосомам и в интерфазных ядрах. Факультативный гетерохроматин неактивной Х-хромосомы и в клетках человека, и в клетках мыши обеднен ацетилированным гистоном Н4 (Jeppesen and Turner, 1993) и в этом отношении напоминает конститутивный, центрический гетерохроматин. Это явилось первой демонстрацией того, что неактивная Х-хромосома маркирована модификацией гистонов специфического типа. Последующие эксперименты, проведенные в нескольких лабораториях, подтвердили эти наблюдения и показали далее, что ацетилированные изоформы всех четырех коровых гистонов (H2A, H2B, H3 и Н4) обеднены и конститутивным, и факультативным гетерохроматином в интерфазных и метафазных клетках (O’Neill et al., 2003 и помещенные там ссылки). В частности, и центрический гетерохроматин, и Xi обеднены H3, ди- и три-метилированным по К4 (H3K4me2 и H3K4me3). Обычно полагают, что эти последние, как и ацетилирование, являются маркерами транскрипционно активного (или потенциально активного) хроматина.